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重組蛋白疫苗研究解決方案
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關于SARS-CoV-2的疫苗研究，識別可能引發對該病毒的免疫反應的抗原決定簇，這是開發新疫苗的重要一步。Takara Bio提供了一系列創新技術來支持這項工作。疫苗的研發包括利用測序和生物信息學分析病毒及宿主基因組以確定潛在的靶標，克隆和分離候選抗原決定簇，測試動物模型的免疫反應，最后對主要候選對象進行臨床試驗。
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病毒與宿主的基因組學
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SARS-CoV-2病毒的全基因組測序，可以提供有價值的有關可能引發免疫反應的潛在抗原決定簇信息。Takara Bio的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian在中國已用于SARS-CoV-2測序，以獲得病毒的全基因組序列。通過對COVID-19感染者或康復者進行免疫分組庫分析，可為進一步促進抗原和疫苗靶標識別提供更多信息。高靈敏度的SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit和SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2可用于監測從感染到康復過程中BCR（B細胞受體）和TCR（T細胞受體）的克隆型變化。
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SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
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· 250 pg-10 ng 的total RNA起始量，樣本稀少也能高效建庫！
· 專為低質量樣本設計，無需進行rRNA前處理操作！
· 隨機引物起始，6小時內即可制備高質量文庫！
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SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
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· 可從外周血單核細胞（PBMC）純化的10 ng-1μg的總RNA或從B細胞純化的1-100 ng的總RNA起始，正確擴增并通過測序鑒別人IgG亞類
· 添加UMI，可校正來自PCR錯誤、重復序列以及序列錯誤的讀取
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SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2
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· 支持total RNA(10 ng-1 μg外周血淋巴細胞來源或 1 ng-100 ng T細胞來源 total RNA)，或者純化后完整的T細胞（1,000-10,000個）起始
· 每次反應僅需一對引物擴增相應的TCR亞基
· 引入UMI建庫，校正PCR偏差及測序錯誤產生的reads
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已有研究人員在針對SARS-CoV-2研究過程中使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian ，這些工作現已發表：
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· Wu, F. et al., A new coronavirus associated with human respiratory disease in China . Nature. Mar;579(7798):265 269. (2020)
· Lu, Jing et al. Genomic Epidemiology of SARS CoV 2 in Guangdong Province, China. Cell vol. 181,5
· Pfefferle, Susanne et al. Complete Genome Sequence of a SARS CoV 2 Strain Isolated in Northern Germany. Microbiology resource announcements vol. 9,23 (2020)
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生物信息學分析
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接下來的一步是對病毒基因組和宿主的BCR和TCR免疫組庫進行生物信息學分析，以揭示SARS-CoV-2的抗原，并選擇疫苗靶標（病毒表面受體）。Takara Bio的Immune Profiler Software可與SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit配合使用，以分析有關克隆型數量和可變區V（D）J序列的信息。
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疫苗靶標的克隆
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研究人員可以利用Cloning Enhancer，質粒純化試劑盒，Stellar感受態細胞以及In-Fusion無縫克隆技術來進行高通量克隆，從而加快病毒受體和疫苗載體的構建：
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· 高效——對于0.5～15 kb的插入片段，克隆效率可超過95%
· 不依賴序列——可在任意載體的任意位置進行任意片段的克隆
· 無縫連接——克隆連接處無多余的堿基對（或疤痕序列）
· 一盒多用——只需一個試劑盒就可進行多片段克隆和定點誘變
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已有研究人員在研發針對冠狀病毒（包括SARS-CoV-2）疫苗的過程中使用了In-Fusion克隆技術，這些工作現已發表：
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· Kato, H. et al. Development of a recombinant replication-deficient rabies virus-based bivalent-vaccine against MERS-CoV and rabies virus and its humoral immunogenicity in mice. PLoS One. 14, DOI:10.1371/journal.pone.0223684 (2019).
· Letko, L., Marzi, A., & Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARSCoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat. Microbiol. 6, 562-569 (2020).
· Terada, Y., Kawachi, K., Matsuura, Y., Wataru, W., Kamitani, W. MERS coronavirus nsp1 participates in an efficient propagation through a specific interaction with viral RNA. Virol. 511, 95-105 (2019).
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表達和純化疫苗靶標
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您可以使用BacPAK桿狀病毒表達系統來表達您感興趣的蛋白質，以用于疫苗開發。該技術易于擴大規模，蛋白質表達水平高，對人體無致病性。此外，該系統產生的靶蛋白在結構、生物活性以及免疫反應性方面與天然蛋白質都是相似的。為了優化重組蛋白質的表達水平，可以使用BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit快速確定病毒的滴度，該試劑盒使用標準免疫測定法在48小時內即可準確測定桿狀病毒滴度，而斑塊和終點稀釋測定法通常需要5-10天。一旦靶蛋白從這些純化的產物中表達出來，就可以使用我們的Capturem新型高容量膜純化技術來快速純化His標簽標記的疫苗候選蛋白：
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· 快速、方便的工作流程——Capturem膜上偶聯鎳離子作為配基，使用方便的純化柱/純化板/過濾裝置，室溫下操作僅需5-30分鐘
· 高純度——柱床體積小，帶入污染少
· 兼容多種添加劑——包括EDTA、DTT、BME、甘油、TCEP等（兼容試劑一覽表）
· 通用性——易于從哺乳動物/細菌的細胞裂解液和上清液中純化
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已有研究人員在疫苗開發工作中使用我們的Capturem His技術發表了研究成果：
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· Do, V. T. et al. Recombinant adenovirus carrying a core neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and heat-labile enterotoxin B of Escherichia coli as a mucosal vaccine. Arch. Virol. 165, 609-618 (2020).
· Martínez-Hernández, S. L. et al. An anti-amoebic vaccine: generation of the recombinant antigen LC3 from Entamoeba histolytica linked to mutated exotoxin A(PEΔIII) via the Pichia pastoris system. Biotechnol. Lett. 39, 1149-1157 (2017).
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使用疫苗靶標對小鼠進行免疫反應，篩選血清的抗病毒活性，并優化有前景的候選對象
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Takara Bio的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit和SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit可用于通過監測BCR和TCR克隆型的多樣性變化，加快針對目標疫苗的抗病毒活性的免疫血清篩選過程。通過分析和比較接種動物在感染病毒之前和之后的抗體和T細胞反應，進一步優化了有前景的候選疫苗。
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SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
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· 支持10 ng-3 μg來自于脾臟、淋巴結、PBMCs 及雜交瘤的總RNA起始
· 在大多數情況下，可以有效擴增并通過測序鑒別小鼠IgG亞類
· 可以高靈敏度地從同一樣品中檢測不同鏈
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SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit
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· 支持10 ng 至500 ng的來源于小鼠脾臟、胸腺或PBMCs的總RNA起始，也可以1,000 至 10,000個純化的T細胞起始
· 可獲得TCR mRNA轉錄本可變區的全長序列
· 可同時或單獨分析TCR兩個亞基的多樣性
· 無需多重PCR，每次反應利用一對引物擴增相應的TCR亞基
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評估選定的最終候選疫苗在臨床試驗中的有效性
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監測免疫反應是評估最終候選疫苗有效性的關鍵。通過NGS對BCR和TCR進行序列分析，可以正確監測克隆型的變化，并識別疫苗特異性的克隆型。
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【產品一覽表】
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新一代測序相關
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表達和純化相關
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克隆相關
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