AAV產品解決方案，一站式配齊AAV研究裝備
2022-04-26文章來源：takarabiomed
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重組腺相關病毒提取純化新利器，兩種方法按需選擇
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腺相關病毒（AAV）不僅是一種生物學研究工具，也作為基因治療載體而為大家所熟知。在基因治療這場競技賽中，腺相關病毒（AAV）載體已經迅速成為體內基因導入主要平臺之一（Goswami et al. 2019）1，為治療常見和罕見遺傳性疾病帶來了新希望。
AAV是一種非包膜的線性單鏈DNA病毒，有100多種血清型，對人類無致病性，只有在輔助病毒（如腺病毒或皰疹病毒）存在的情況下才會復制。經過重組和改造的AAV擁有不同的血清型，根據血清型不同而具有不同的宿主范圍和病毒特征，可以有效作用于特定細胞類型，包括分裂和非分裂細胞類型。使用者需要根據靶標細胞或者組織類型選擇適合的血清型。目前使用頻率較高的血清型為AAV2，其它血清型也逐漸被廣泛使用。
AAV之所以作為治療研究的高效基因傳遞工具而被認可，正是因為它具有對人類無致病性、持續的病毒持久性、具備使用多種重組AAV血清型可靶向特定細胞和組織類型的能力(Büning 2019)2。而要充分發揮這項潛能，AAV必須具有高純度。除此以外，當使用AAV進行動物個體基因導入時，使用高純度的病毒粒子可以去除源自病毒包裝細胞和培養基的雜質。在向培養細胞導入基因時，使用純化后的AAV可以消除雜質所帶來的影響。
然而，目前許多AAV純化模式依賴于血清型，需要針對每個血清型進行單獨的方法開發和優化，這無疑是繁瑣和不便的。我們的AAVpro “All Serotypes” 系列提供2種適用于所有血清型的AAV提取純化方法，使用方便，可按需選擇。
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“秘制”提取純化法
從包裝細胞和培養上清液中提取純化
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不同血清型和不同包裝細胞培養條件下，AAV粒子在包裝細胞和細胞培養液中的分配比例有所不同。對于除AAV2以外的血清型，病毒粒子在細胞培養上清液中可能比在細胞裂解液中更有代表性(Vandenberghe et al., 2010)3。同時從包裝細胞和培養上清液中提取純化AAV粒子，可以獲得更高的病毒產量。
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AAVpro Cell & Sup. Extraction/Concentration Pack Maxi (All Serotypes) 通過使用特別的AAV病毒提取方法，從AAV包裝細胞和培養上清液中提取病毒粒子，提供更高的病毒產量，不需要像凍融法和超聲波破碎法那樣繁瑣的操作。
AAVpro Purification Pack Maxi(All Serotypes) 可用于進一步純化AAV病毒提取液，獲得高純度AAV粒子。這種純化方法可用于從病毒提取液中純化任何血清型的AAV粒子，無需超速離心。純化獲得的高純度的AAV粒子，可直接用于體內轉導或培養細胞的轉導。該試劑盒中已包含了Cryonase冷啟動核酸酶。
上述兩者搭配使用，可在大約7小時內從包裝細胞及其培養上清液中純化獲得高純度AAV粒子，操作簡便節省時間，重要的是可適用于任何血清型。從純化量上來說，也是非常友好的，包含4次AAV純化所需要的緩沖液和純化柱，每次可以純化5個T225培養瓶收集的包裝細胞和培養上清液中的AAV粒子。
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凍融提取純化法
從包裝細胞中提取純化，活細胞或者冷凍細胞
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凍融法是從包裝細胞中提取AAV粒子的常用方法之一。通常的操作是使用液氮破碎細胞，將細胞置于液氮中凍結，再放至37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。這樣反復凍融3-4 次，需要花費至少30-40分鐘的時間。
AAVpro Freeze-Thaw Extraction Buffer（All Serotypes）是一款經過優化的細胞懸浮液，用于通過凍融法從AAV包裝細胞中提取AAV粒子，活細胞或者冷凍細胞都可以。使用該緩沖液懸浮包裝細胞，只需要一次凍融操作就能高效提取各種血清型AAV粒子。
如前所述，AAVpro Purification Pack Maxi(All Serotypes)可用于進一步純化AAV病毒提取液，獲得高純度AAV粒子。與AAVpro Freeze-Thaw Extraction Buffer（All Serotypes）配合使用，可以在大約4個小時內純化并濃縮AAV包裝細胞中的AAV粒子，以獲得高純度AAV粒子，而無需超速離心等繁瑣操作。
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無論是哪一種提取純化方法，我們都對提取純化后AAV粒子的純度和感染性能進行了測評。這兩種提取純化方法都可以幫助研究人員獲得高純度的AAV粒子，并且這些高純度的AAV粒子依然保持其感染能力。研究人員可以根據需求，選擇相對應的提取純化方法。
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在AAV方面，Takara Bio具有完善的AAV產品解決方案，一站式配齊AAV研究裝備。>>了解更多
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References
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1. Goswami, R. et al., Gene therapy leaves a vicious cycle. Front. Oncol. 9, doi: 10.3389/fonc.2019.00297.
2. Büning, H. and Srivastava, A. Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 12, 248–265 (2019).
3. Vandenberghe et al., Efficient Serotype-Dependent Release of Functional Vector into the Culture Medium During Adeno-Associated Virus Manufacturing. Human Gene Therapy. 21, 1251–1257 (2010).
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