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帶分子標簽的微量樣本的鏈特異RNA-Seq分析

2021-04-27文章來源：takarabiomed

帶分子標簽的微量樣本的鏈特異RNA-Seq分析
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian

· 高靈敏度：可以人、大鼠或小鼠來源的250 pg-10 ng的總RNA或10-1000個細胞起始
· 添加UMI：校正來自PCR錯誤、重復序列以及序列錯誤的讀取
· 用途廣泛：能分析質量較差的FFPE、LCM以及cfRNA來源的樣本
· 操作簡便：僅需要7.5小時即可完成文庫構建
· 無縫銜接Illumina測序：直接制備多達192種index的Illumina^® -ready文庫

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3）設計用于從皮克級總RNA(250 pg-10 ng)中高效制備Illumina測序文庫。本試劑盒采用的技術適用于高品質、部分降解及低品質RNA（如來自于FFPE或LCM樣品）。升級產品與原有SMARTer 皮克級產品相比，提升了在所有Illumina測序平臺的測序性能，并且還添加特別的分子條形碼（UMI），從而可以消除PCR錯誤或duplication以及測序偏向。

本試劑盒采用一體化操作流程，保留了鏈來源信息，在反轉錄和PCR擴增過程中就可以添加indexes和接頭。整個流程，包括文庫構建及純化僅需約7.5小時。
該試劑盒包含SMARTer RNA Unique Dual Index Kit - 24U (Code No. 634451)。另外也可以與SMARTer RNA Unique Dual Index Kits (Code No. 634452 & 634457，可單獨購買）搭配使用，最多可構建多達192種indexes文庫。

圖1. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian技術流程

圖2. 使用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian制備文庫的結構特征

接頭序列包含：通過PCR 1反應添加的可以與Illumina流動池結合生成簇的P7、P5序列（P7以淡藍色表示，P5以紅色表示），用于區分單個lane上多個樣本的Index序列（Index 1 [i7] 序列連接在P7端，Index 2 [i5]連接在P5端）。并且還包括識別測序引物區域的Read 2（紫色）和 Read 1（綠色）。通過Read 1起始得到的原始RNA的反義鏈序列，Read 2起始獲得的是原始RNA的正義鏈序列。其中，通過Read 2起始時，前8個堿基是UMI（深紫色），UMI之后的3個堿基（XXX）是Pico v3 Adapter衍生的序列。

表 1. 不同樣本起始量的分析結果。

以0.5、1、5和10 ng人肺FFPE組織提取的總RNA起始，采用SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian制備RNA-Seq文庫（均做兩個重復），并使用NextSeq 500進行測序。

Technote：
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SMARTer Stranded RNA-Seq Pico v3:
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