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AAV實力硬核，罕見病AADC缺乏癥治療臨床試驗療效積極
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基因治療將使醫學領域發生革命，為治療常見和罕見遺傳性疾病帶來了新希望。在基因治療這場競技賽中，腺相關病毒（AAV）載體已經迅速成為體內基因導入主要平臺之一（Goswami et al. 2019）1。
由于AAV載體免疫原性和細胞毒性低，能夠轉導非分裂細胞，并且整合到宿主基因組中的頻率非常低，因此被眾多研究學者認為安全性更高。經過重組和改造的AAV載體擁有不同的血清型，根據血清型不同而具有不同的宿主范圍和病毒特征，可以有效作用于特定細胞類型，包括分裂和非分裂細胞類型。使用者需要根據靶標細胞或者組織類型選擇適合的血清型。目前使用頻率較高的血清型為AAV2，其它血清型也逐漸被廣泛使用。
迄今為止，已有兩種AAV基因療法被FDA批準。第一種為Luxturna，于2017年獲得批準用于治療萊伯氏先天性黑蒙癥，這是一種遺傳性視網膜疾病。第二種為Zolgensma，于2019年獲得批準用于治療小兒脊髓性肌萎縮癥。除了以上這兩種獲得批準的治療方法外，其他幾種AAV療法已經或者正在世界范圍內開展臨床試驗進行評估。重組AAV載體的安全性和有效性已在多個Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗中得到證實。
由于血腦屏障（BBB）的存在，治療中樞神經系統疾病是非常具有挑戰性的。研究發現，許多AAV載體，尤其是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9，對神經元的轉導是非常有用的2。因此，許多AAV介導的治療方法已經或者正在試驗中，以治療溶酶體儲存障礙、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥（ALS）、癲癇、1型脊髓性肌萎縮癥、異染性腦白質營養不良、芳香族L-氨基酸脫羧酶（AADC）缺乏癥和巴頓病（Goswami et al. 2019）1。
其中芳香族L-氨基酸脫羧酶（AADC）缺乏癥是一種罕見的神經肌肉疾病，由于DDC基因突變所引起。AADC缺乏癥的主要病癥是運動障礙，包括自主運動喪失、張力減退、間歇性眼病危象（OGC）和肢體肌張力障礙。AADC缺乏癥表現在嬰兒早期，嚴重情況下會使患者終生臥床不起。目前AADC缺乏癥還沒有特別好的治療辦法，藥物治療只對中度或輕度表型患者有輕微效果，但對大多數重癥患者療效甚微。
截止到2020年11月，Clinical Trials. Gov上登記數據顯示，開展AADC缺乏癥臨床試驗的項目為4項，目前正處于I期或者II期臨床試驗階段，這些研究均使用AAV2作為體內基因導入平臺。除此之外，2019年自治醫科大學Kojima et al.發表了一項I期和II期試驗結果3，該試驗旨在研究AAV療法對4-19歲、DDC基因突變患者的影響。作者以AAV為介導導入DDC基因，通過雙側肺輸注的方式給藥，將表達人DDC基因的臨床級AAV載體（由Takara Bio Japan提供AAV載體包裝制備服務）作用于6例患者，其中5例是臥床不起的患者。輸注后，作者監測了患者的運動、認知和語言功能，同時也監測了由AAV載體引起的任何不良反應。作者發現，6名患者的運動功能都得到了改善，阿爾伯塔嬰兒運動量表（AIMS）分數的增加可以證明這一點。在進行基因治療之前， 患者1、4、5和6的AIMS得分為0，患者2的得分為1，患者3的得分為52。接受治療之后，所有患者的得分均得到改善。接受治療12個月時，患者3的得分達到了58，是所有患者的最高得分。治療后，一名臥床不起的患者在助行器協助下能夠下床行走，另外兩名患者能夠在有所支撐的情況下站立。與AADC缺乏癥相關的其他病癥在所有患者中均有所改善，包括肌張力障礙、多涎、呼吸困難和情緒障礙。在治療過程中沒有觀察到嚴重的不良反應，這表明這種AAV介導的基因治療對AADC缺乏癥患者來說，可能是一種安全有效的治療方法。這項研究證明了AAV載體在治療像AADC缺乏癥這樣的罕見遺傳疾病方面是有潛力的。
作為體內基因導入主要平臺之一，AAV已經在多個疾病治療臨床試驗中顯現出有明顯的治療效果，而且不會引起顯著的不良免疫反應。比如在REP1基因突變導致的無脈絡膜癥、CNGB3基因突變導致的色盲或者全色盲、線粒體DNA點突變和ATP生成障礙所引起遺傳性視神經病變（LHON）這些遺傳性眼科疾病方面，研究結果顯示接受AAV基因治療后患者視力有所提高4,5,6。AAV也是一種廣泛應用于癌癥基因治療的病毒載體。多種AAV載體已被用于腫瘤治療，眾多臨床前研究結果顯示，AAV基因治療成功抑制腫瘤生長，致使腫瘤消退。另外，AAV還廣泛應用于血液病、代謝類等疾病的治療研究，展現出了廣闊的應用前景。
Takara Bio作為先進的生物技術企業，從基礎研究到新藥開發等領域，我們都可以向生物技術研究和產業支援提供支持。在AAV基因治療研究領域，Takara Bio具有完善的AAV產品解決方案——從表達、包裝、提取到純化和滴度測定，一站式配齊您的AAV載體研究裝備。
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◆ 無輔助病毒AAV載體制備系統
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AAV Helper Free System是一種特別的可制備高滴度AAV的無輔助病毒系統，可提供AAV 1型 (AAV1) 、2型 (AAV2) 、5型 (AAV5) 、6型 (AAV6) 制備系統。我們在該系統的包裝載體中引入了一種可提高病毒滴度的人源miRNA（hsa-miR-342），與一般只表達Rep基因和Cap基因的pRC2 Vector相比，病毒滴度可提高2倍。由于AAV是一種微小病毒，可克隆的目的基因片段大小限制在不超過2.5 kb。>>了解詳情
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◆ 強強聯合的AAV-CRISPR系統
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AAV與CRISPR/Cas9基因編輯技術結合使用，可以通過AAV載體導入CRISPR/Cas9進行基因治療，可以讓更多無望治療的疾病變成有望治愈，將基因治療推向了一個新高度。在AAV-CRISPR 系統方面，可以提供釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）兩種不同來源Cas9的系統。攜帶釀膿鏈球菌來源的Cas9（SpCas9）的AAV-CRISPR系統，是一個雙載體系統，利用了AAV自身的同源重組特性，在不影響病毒正常制備的情況下，可以將長度約為4.1 kb SpCas9基因導入至靶細胞。攜帶金黃色葡萄球菌來源的Cas9（SaCas9）的AAV-CRISPR系統，是一個單載體系統，使用相對簡便。不過需要注意的是，與SpCas9不同，SaCas9所識別的PAM序列為NNGRR(T)，N表示任意堿基，R表示A或者G，T具有較強的偏好性。>>了解詳情
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◆ 擴大AAV載體產量必備單品
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AAV2傾向于保留在制備細胞中（由于肝素結合域的原因），可以使用專用的提取試劑AAVpro Extraction Solution從制備細胞中提取并回收病毒粒子。而其他血清型AAV，更容易釋放到培養液中，因此從培養液中分離AAV可以有效擴大AAV載體產量。AAVpro Concentrator就是可以從細胞培養上清液中分離濃縮任何血清型AAV載體這樣一種簡便高效的方法。
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與僅涉及AAV顆粒沉淀的其他濃縮方法相比，AAVpro Concentrator操作過程中包含了過濾步驟，可以產生更高純度的AAV載體。而混合-離心的操作流程適用于各種起始量，易于擴展濃縮規模，并且手動操作時間不到一個小時。整個操作過程沒有超速離心步驟，使用普通離心機就可完成。我們使用AAVpro Concentrator將40 ml培養液上清濃縮至200 μl，病毒滴度可提高95倍，回收率大約為48%。我們通常通過生物學分析方法來檢測所制備的AAV載體的感染性滴度，使用AAV載體感染允許細胞(permissive cell)并測定轉基因表達量，確定轉導單位（TUs）。以MOIs為5,000或500的濃縮后AAV載體感染靶細胞，其感染效率分別為44.7％或9.2％。>>了解詳情
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◆ 通用簡便的AAV載體純化方式
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AAV載體作為體內基因導入的主要平臺之一，使用高純度的病毒粒子是很有必要的，需要去除源自病毒包裝細胞和培養基的雜質。即便是將基因導入至培養細胞時，使用純化后的AAV粒子也可以消除雜質所帶來的影響。AAV粒子的純化通常使用CsCl密度梯度超速離心法或碘克沙醇超速離心法，但這兩種方法不僅需要熟練的操作手法，同時還存在耗時長和回收率低等問題。
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Takara通用型AAVpro Purification Kit不受血清型限制，可以從AAV粒子制備細胞中純化出AAV粒子，并且可以在4個小時內操作完成。本試劑盒使用了特別的AAV粒子提取方法，省去了凍融和超聲破碎等繁瑣操作；特別的AAV載體純化方法，通過簡單的操作即可有效去除雜質。我們可提供兩種不同純化規格，方便從不同細胞數量中純化病毒粒子。>>了解詳情
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◆ 通用快速的AAV滴度測定方法
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基于qPCR技術開發了通過測定AAV基因組來測定AAV滴度的試劑盒，同以往的DNA印跡法和ELISA法相比，可以更準確、更快速地(2.5小時以內)獲得實驗結果。AAVpro Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2試劑盒中的引物特異針對AAV載體的公共區域AAV2反向末端重復序列（ITR）而設計，如果載體的ITR區域來自AAV2（實際上常用的AAV載體也正是這樣的情況），那么無論您制備出的AAV病毒是哪種血清型（取決于病毒包裝時所使用的Cap基因），都可以使用這個試劑盒測定病毒滴度。下圖所示檢測結果表明，對于每個血清型（AAV1、AAV2、AAV6），通過實時PCR擴增CMV區域或者ITR區域所測定的病毒滴度大致相同。如果您不確定該試劑盒是否適用于您的載體，請與我們的技術服務部門聯系，并提供您的載體序列。>>了解詳情
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References
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1. Goswami, R. et al., Gene therapy leaves a vicious cycle. Front. Oncol. 9, doi: 10.3389/fonc.2019.00297.
2. Hocquemiller M, Giersch L, Audrain M, Parker S, Cartier N. Adenoassociated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum Gene Ther. (2016) 27:478–96. doi: 10.1089/hum.2016.087
3. Kojima, K. et al., Gene therapy improves motor and mental function of aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency. Brain 42, 322–333 (2019).
4. Edwards TL, Jolly JK, Groppe M, Barnard AR, Cottriall CL, Tolmachova T, et al. Visual Acuity after Retinal Gene Therapy for Choroideremia. N Engl J Med. (2016) 374:1996–8. doi: 10.1056/NEJMc1509501
5. Sengillo JD, Justus S, Cabral T, Tsang SH. Correction of monogenic and common retinal disorders with gene therapy. Genes (Basel). (2017) 8:E53. doi: 10.3390/genes8020053
6. Feuer WJ, Schiffman JC, Davis JL, Porciatti V, Gonzalez P, Koilkonda RD, et al. Gene therapy for leber hereditary optic neuropathy: initial results. Ophthalmology. (2016) 123:558–70. doi: 10.1016/j.ophtha.2015.10.025
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