国产爽一区二区久久久a片 ,日韩妆和欧的一区二区区别在哪,人马杂配mv的视频大全

您當前的位置：首頁 > 新聞動態 > 新聞中心

新聞動態

News

使用Co-IP方法驗證蛋白質相互作用的解決方案

2018-08-29文章來源：Takarabiomed

使用Co-IP方法驗證蛋白質相互作用的解決方案

在酵母雜交實驗中，由于文庫的構建是通過cDNA片段鏈接到質粒上的，所以有時會產生2/3移碼突變或者編碼蛋白質提前終止的假陽性情況。因此，在研究蛋白質互作過程中，酵母雜交篩選出相關蛋白質后，還需用其他方法進行驗證，看看目的蛋白質和篩選出的文庫蛋白質是不是“真愛”。免疫共沉淀法（Co-IP），是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。傳統的Co-IP方法是用預先固化在瓊脂糖珠上的protein A的抗體免疫沉淀A蛋白質，那么與A蛋白質在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來，以此來驗證篩選出的蛋白質是否具有相互作用。這一次我們將介紹一種突破性的免疫共沉淀Kit——635721 Capturem^? IP&Co-IP,采用特殊工藝將protein A固定在新型Capturem^? 膜上，從而大幅度縮短實驗時間，并提高純化效果。

接下來我們看一下完成酵母雜交蛋白質篩選實驗后，該如何采用Co-IP方法進行驗證。這里我們可以引入標簽蛋白質myc或者HA，利用標簽抗體來進行Co-IP實驗。這兩種標簽蛋白質具有良好表征和高免疫反應性，同時也很容易通過Western Blotting實驗進行檢測。此外，由于Myc和HA是小標簽，所以通常不會影響目的蛋白質的功能。

關于如何引入myc或者HA標簽，實際上是非常簡單的。首先我們來看一下Clontech Matchmaker酵母雙雜交系統中的BD載體和AD載體：

這兩種載體在bait序列和文庫序列的插入位點前面，分別有兩個蛋白質標簽基因：c-myc和HA。這樣，我們就可以通過PCR的方法，合并目的蛋白質和抗原標簽蛋白質序列：

將Bait-c-Myc與Library-HA構建到合適的載體上，這里可以選擇Clontech 631604 pCMV-Myc & pCMV-HA Vector Set這款載體套裝。這款載體套裝可以使哺乳動物細胞表達標簽融合蛋白質，同時還提供了myc和HA標簽蛋白質抗體，方便于后續Co-IP實驗和WB實驗。Bait-c-Myc與Library-HA克隆到對應載體上后，將載體轉染到哺乳動物細胞表達，之后就可以進行Co-IP實驗了。

關于Co-IP實驗部分，我們強烈推薦Capturem^? IP&Co-IP的方法，我們可以將它與傳統的protein A瓊脂糖珠方法進行比較。首先來看傳統的protein A瓊脂糖珠的方法：

整個流程需要接近16-18 h。也就是說，僅僅是Co-IP純化的實驗就要消耗1天的實驗時間。而使用我們的新方法Capturem^? IP&Co-IP，采用特殊工藝將protein A固定在新型Capturem^? 膜上，利用抗體和protein A可以結合在一起的特點，從而實現抗體-互作蛋白質復合物的純化。我們來看一下具體操作流程：

我們從流程圖中可以看到，抗體和蛋白質裂解液孵育需要10 min，每個柱子最多可加入800 μl包含抗原抗體復合物的樣品，然后用100 μl wash buffer洗滌， 30-50 μl elution buffer洗脫。每個步驟之間僅需1,000×g離心1 min，樣品與抗體孵育后，從上樣到洗脫純化，僅需5 min，宛如魔法一般神奇！由于樣品在Capturem^?膜上停留的時間短，所以可以很大程度的避免了復合物的凝集、解體或失活，從而提高純化實驗的成功率。

上面的Co-IP實驗是基于哺乳動物細胞表達融合蛋白質完成的，如果是植物蛋白質做Co-IP，就需要用到另一種方案：

可以說，Co-IP部分的實驗流程和前面是一樣的，區別在于植物蛋白質的Co-IP需要用植物蛋白質表達載體（可以選擇使用Takara Code No. 3261 pRI 910 DNA）表達標簽融合蛋白質。由于植物基因的導入過程相對來講稍微繁瑣，需要用到農桿菌轉化法將重組質粒在煙草或者擬南芥等模式植物中進行表達。

以上就是Co-IP方法對互作蛋白質進行驗證的實驗方法，如果有誘餌或捕獲蛋白質的抗體，那就可以直接用Capturem^? IP&Co-IP中的細胞裂解液裂解細胞，之后與抗體孵育，再對抗體-互作蛋白質復合物進行純化；如果沒有對應的抗體，則需要引入標簽蛋白質，利用標簽蛋白質抗體完成Co-IP的實驗。

“確認過眼神，我遇上對的Kit。”使用Capturem^? IP&Co-IP將大量解放您的實驗時間，提高您的實驗效果，為您的實驗提供更多的選擇！

荫道bbwbbb高潮潮喷,用劲太爽了再深一点,姐姐片多多免费高清电视剧叶

新聞動態

使用Co-IP方法驗證蛋白質相互作用的解決方案