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■ 制品內(nèi)容 (10 次量)
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AP1 Primer (100 pmol/μl )
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30 μl
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AP2 Primer (100 pmol/μl )
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30 μl
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AP3 Primer (100 pmol/μl )
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30 μl
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AP4 Primer (100 pmol/μl )
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50 μl
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Control Template (100 ng/μl )*1
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10 μl
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Control Specific Primer SP1 (10 pmol/μl )*2
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10 μl
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Control Specific Primer SP2 (10 pmol/μl )*2
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10 μl
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Control Specific Primer SP3 (10 pmol/μl )*2
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10 μl
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TaKaRa LA Taq (5 U/μl )
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25 μl
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10 × LA PCR Buffer II (Mg2+plus)
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1 ml
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dNTP Mixture (2.5 mM each)
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400 μl
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6 × Loading Buffer
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1 ml
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*1 Control Template 是Human HL60來源的基因組DNA。
*2 Control Specific Primers是根據(jù)人基因組中的ALDOA基因設(shè)計(jì)的特異性引物。
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■ 制品說明
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染色體步移技術(shù) (Genome Walking) 是一種重要的分子生物學(xué)研究技術(shù)，使用這種技術(shù)可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。染色體步移技術(shù)主要有以下幾方面的應(yīng)用：
1. 根據(jù)已知的基因或分子標(biāo)記連續(xù)步移，獲取人、動(dòng)物和植物的重要調(diào)控基因，可以用于研究結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)控。如分離克隆啟動(dòng)子并對(duì)其功能進(jìn)行研究；
2. 步查獲取新物種中基因的非保守區(qū)域，從而獲得完整的基因序列；
3. 鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，鑒定基因槍轉(zhuǎn)基因法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點(diǎn)等；
4. 用于染色體測(cè)序工作中的空隙填補(bǔ)，獲得完整的基因組序列；
5. 用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接。
對(duì)于基因組測(cè)序已經(jīng)完成的少數(shù)物種 (如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等) 來說，可以輕松地從數(shù)據(jù)庫(kù)中找到某物種已知序列的側(cè)翼序列。但是，對(duì)于大多數(shù)生物而言，在不了解它們的基因組序列以前，想要知道一個(gè)已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，只能采用染色體步移技術(shù)。
以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的染色體步移的主要問題是在預(yù)先不了解未知區(qū)域序列信息的情況下，如何設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性引物來擴(kuò)增未知區(qū)域。而傳統(tǒng)的染色體步移方法，如：反向PCR法、連接接頭法等，都有操作復(fù)雜、非特異性擴(kuò)增、連接效率低等弊端。
本試劑盒是一種根據(jù)已知基因組DNA序列，高效獲取側(cè)翼未知序列的試劑盒。相對(duì)于其它傳統(tǒng)方法，本試劑盒具有高效、簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度高、一次性獲得的未知序列較長(zhǎng)等特點(diǎn)。其主要原理是根據(jù)已知DNA序列，分別設(shè)計(jì)三條同向且退火溫度較高的特異性引物(SP Primer)，與試劑盒中提供的四種經(jīng)過特別設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)。通常情況下，其中至少有一種兼并引物可以與特異性引物之間利用退火溫度的差異進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)，通過三次巢式PCR反應(yīng)即可獲取已知序列的側(cè)翼序列。如果一次實(shí)驗(yàn)獲取的長(zhǎng)度不能滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，還可以根據(jù)第一次步移獲取的序列信息，繼續(xù)進(jìn)行側(cè)翼序列獲取。此外，本試劑盒中還含有Control DNA及Control Primer，可以方便進(jìn)行Control實(shí)驗(yàn)。
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■ 試劑盒原理：以使用兼并引物AP1為例。
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圖1. Genome Walking Kit的實(shí)驗(yàn)原理圖
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■ 各種引物的序列
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引物名稱
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引物序列 (5’→3’)
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Control Specific Primer SP1
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AAATGCTGCAGCCTCCCTCTCACCC
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Control Specific Primer SP2
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AATACCAGAAATGTGCCCTCCCGTG
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Control Specific Primer SP3
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TGAGCTGGCAGGTTGTAGTCTCTGT
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■ 特異性引物的設(shè)計(jì)
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圖2. Genome Walking Kit特異性引物設(shè)計(jì)示意圖
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特異性引物設(shè)計(jì)原則：
根據(jù)經(jīng)過驗(yàn)證的已知序列區(qū) (最好不少于500 bp) 設(shè)計(jì)三個(gè)特異性引物 (見上圖)：設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，SP2的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在SP1的內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，一般以60-100 bp為宜。引物設(shè)計(jì)原則：引物的長(zhǎng)度為22-26 nt，GC含量45-55%，Tm值60-70℃，引物Tm值計(jì)算公式：Tm=69.3+0.41(G/C)%×100 - 650/L (引物堿基數(shù))。其他要求和普通PCR反應(yīng)用引物相同。
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■ 注意事項(xiàng)
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1. 使用本試劑盒時(shí)，進(jìn)行三次PCR反應(yīng)時(shí)使用的AP引物必須是同種AP引物，即：1st PCR反應(yīng)時(shí)使用的是AP1，則2nd和3rd PCR反應(yīng)都必須使用AP1。對(duì)于不同物種，各條AP引物的擴(kuò)增效率各不相同。
2. 在設(shè)計(jì)特異性引物時(shí)，SP3 Primer不要距離未知序列區(qū)域太遠(yuǎn)，一般以100-200 bp為宜，以增加獲取未知序列的有效長(zhǎng)度。
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