PCR準(zhǔn)則

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是K.Mullis和其合作者在1985年發(fā)明的，它給分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)帶來(lái)了革命性的影響。一些主要的研究領(lǐng)域，包括生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、基因調(diào)控和癌癥研究，不斷地提出更多的要求，對(duì)當(dāng)今的PCR計(jì)術(shù)提出了更高的挑戰(zhàn)。這其中就包括對(duì)高通量、更高的實(shí)驗(yàn)靈敏性以及更可靠的數(shù)據(jù)分析的要求。實(shí)驗(yàn)的發(fā)展和評(píng)價(jià)，數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，以及得到結(jié)果需要的時(shí)間，仍然是研究者所面臨的主要問(wèn)題。

PCR擴(kuò)增是一種常規(guī)的技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展了數(shù)以千計(jì)的PCR實(shí)驗(yàn)方案，但是研究者仍然會(huì)遇到PCR實(shí)驗(yàn)的技術(shù)困難，并經(jīng)常不能獲得特異性的PCR產(chǎn)物。盡管也有幾種其它的挑戰(zhàn)（比如，脫尾，低產(chǎn)率和非特異性擴(kuò)增），PCR失敗或者結(jié)果較差的原因主要有兩個(gè)：反應(yīng)的特異性和模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

PCR既是一個(gè)熱動(dòng)力學(xué)過(guò)程也是一個(gè)酶催化過(guò)程。成功的real-time PCR，需要在最佳的條件下進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，每一個(gè)反應(yīng)成分都會(huì)影響結(jié)果。退火步驟對(duì)PCR反應(yīng)的特異性非常關(guān)鍵。如果引物能夠與模板高度特異性的結(jié)合，則會(huì)提高特異性的PCR產(chǎn)物，并且增強(qiáng)擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏性。但是由于反應(yīng)中較高的引物濃度，引物可能會(huì)與非互補(bǔ)的序列雜交，發(fā)生錯(cuò)配。如果引物與模板序列結(jié)合的特異性較低，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體。擴(kuò)增反應(yīng)中，預(yù)期PCR產(chǎn)物與假體的競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)降低特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而降低real-time PCR的靈敏性和線性范圍。較低的PCR特異性，能顯著的影響PCR的定量檢測(cè)，特別是使用SYBR Green作為檢測(cè)試劑的時(shí)候。由于SYBR Green能夠與所有雙鏈DNA序列結(jié)合，引物二聚體以及其它非特異性的PCR產(chǎn)物都會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。這導(dǎo)致反應(yīng)整體靈敏度降低，并導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的定量不準(zhǔn)確。PCR反應(yīng)中，對(duì)反應(yīng)的特異性至關(guān)重要的因素包括，引物設(shè)計(jì)和所使用的反應(yīng)化學(xué)試劑。

PCR引物設(shè)計(jì)

最佳的引物序列和合適的引物濃度，對(duì)于PCR反應(yīng)達(dá)到最大的特異性和最高的效率至關(guān)重要。表“引物設(shè)計(jì)和使用準(zhǔn)則”提供了標(biāo)準(zhǔn)和多重PCR以及一步法RT-PCR反應(yīng)中，引物設(shè)計(jì)和使用的概述。

引物設(shè)計(jì)和使用準(zhǔn)則

	標(biāo)準(zhǔn)PCR	多重PCR	一步法RT-PCR
片段長(zhǎng)度	18–30 nt	21–30 nt	18–30 nt
GC含量	40–60%	40–60%	40–60%
Tm信息	所有引物對(duì)應(yīng)該具有類似的Tm值	所有引物對(duì)應(yīng)該具有類似的Tm值。為了得到最佳的結(jié)果，Tm值應(yīng)該在60–88°C之間。	所有引物對(duì)應(yīng)該具有類似的Tm值。Tm值不應(yīng)低于逆轉(zhuǎn)錄的溫度（比如，50°C）
估計(jì)最佳退火溫度	比計(jì)算的Tm值低5°C	比計(jì)算的Tm值低5–8°C（當(dāng)Tm高于68°C時(shí)）或者比計(jì)算的Tm值低3–6°C（當(dāng)Tm在60–67°C之間時(shí)）	比計(jì)算的Tm值低5°C
位置	–	–	為了避免檢測(cè)到gDNA：引物應(yīng)該與一個(gè)外顯子的3’端和相鄰?fù)怙@子的5’端雜交。 或者引物應(yīng)該與覆蓋至少一個(gè)內(nèi)含子的區(qū)域雜交。 如果僅知道m(xù)RNA序列，引物的結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該相距300–400 bp。
濃度，與A260的單位吸光度對(duì)應(yīng)的濃度相當(dāng)	20–30 μg	20–30 μg	20–30 μg

PCR引物轉(zhuǎn)化為摩爾

引物長(zhǎng)度	pmol/μg	20 pmol
18mer	168	119 ng
20mer	152	132 ng
25mer	121	165 ng
30mer	101	198 ng

在設(shè)計(jì)PCR引物的時(shí)候，應(yīng)該考慮如下因素，并且這些因素對(duì)于所有類型的PCR都適用：

• T_m值計(jì)算：2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
• 避免引物對(duì)3’端的2–3個(gè)堿基互補(bǔ)
• 避免引物3’端與模板錯(cuò)配
• 避免引物的3’端出現(xiàn)3個(gè)或者更多個(gè)C或者G
• 避免引物序列本身互補(bǔ)和引物對(duì)之間互補(bǔ)
• 避免3’端的末端堿基是T
• 確保引物序列對(duì)于模板序列是獨(dú)特的
• 每個(gè)引物的濃度應(yīng)該在0.1–1.0 μM。對(duì)于很多應(yīng)用而言，0.2 μM 的引物濃度就足夠了

凍干的引物應(yīng)該在少量的蒸餾水或者TE中溶解，以制備濃縮的原液。制備濃度為10 pmol/μl的若干等分工作溶液，以避免重復(fù)冷凍和融解。所有的引物溶液儲(chǔ)存在 –20°C條件下。使用變性的聚丙烯酰胺凝膠來(lái)檢測(cè)引物的質(zhì)量，應(yīng)該僅觀察到一個(gè)條帶。

PCR的條件

對(duì)于每個(gè)引物對(duì)，都應(yīng)該優(yōu)化PCR緩沖溶液中的引物和Mg²⁺濃度以及反應(yīng)的退火溫度，以高效率的進(jìn)行PCR反應(yīng)。除此之外，一些能增強(qiáng)DNA聚合酶的穩(wěn)定性和續(xù)進(jìn)性，或者通過(guò)降低非特異性的引物–模板相互作用而增強(qiáng)雜交的嚴(yán)格性的添加劑，也能改善PCR反應(yīng)的效率(1)。使用高純度的反應(yīng)試劑，對(duì)于PCR反應(yīng)的成功非常關(guān)鍵，特別是對(duì)于稀有模板的擴(kuò)增反應(yīng)，比如，基因組DNA中的單個(gè)拷貝的基因或者從被感染的生物體中分離出來(lái)的基因組DNA上的病毒DNA序列。
對(duì)照反應(yīng)對(duì)于監(jiān)控PCR反應(yīng)的成功是非常必要的。在任何可能的情況下，都應(yīng)該使用陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)確保使用的PCR的反應(yīng)條件能成功的擴(kuò)增目標(biāo)序列。由于PCR是一種靈敏性極高的技術(shù)，僅需要目標(biāo)模板的幾個(gè)拷貝，因此，一定要使用不含模板DNA的陰性對(duì)照，來(lái)確保PCR使用的溶液沒(méi)有被模板DNA分子所污染。

PCR反應(yīng)應(yīng)該與PCR分析在互相隔離的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，以確保PCR使用的試劑沒(méi)有被PCR產(chǎn)物所污染。同樣，分析PCR產(chǎn)物時(shí)使用的試管，絕對(duì)不能用于PCR反應(yīng)。

引物退火的特異性與PCR緩沖溶液

在PCR反應(yīng)中，引物與模板上互補(bǔ)的DNA序列發(fā)生退火。對(duì)于成功的擴(kuò)增，引物退火必須具有特異性。為了在較短的退火時(shí)間內(nèi)有效的雜交，引物的濃度必須很高，這會(huì)導(dǎo)致引物與非互補(bǔ)的序列退火。非特異性退火所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠與特異性的擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)，并極大的減少特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量。

成功的PCR反應(yīng)，需要維持較高的引物分子特異性退火和非特異性退火的比例。退火主要受到PCR緩沖溶液的成份（特別是陽(yáng)離子）和退火溫度的影響。特殊的陽(yáng)離子組合，能在較大的退火溫度范圍內(nèi)保持較高的退火特異性。這使得不再需要對(duì)于每一種引物–模板體系都優(yōu)化退火溫度，并且允許使用具有不同的引物退火溫度的非理想的PCR實(shí)驗(yàn)。

退火溫度

最佳的引物退火溫度取決于堿基的組成（即A、T、G、C核苷酸的比例）、引物濃度和離子反應(yīng)環(huán)境。

鎂離子的濃度

鎂離子是DNA聚合酶重要的輔助因子，對(duì)于酶的活性非常關(guān)鍵。Mg²⁺與擴(kuò)增反應(yīng)中的DNA，引物和核苷酸相結(jié)合。Mg²⁺的濃度通常要高于dNTP和引物，并且針對(duì)于不同的模板和引物，其濃度需要進(jìn)行優(yōu)化。如果Mg²⁺的濃度高于最佳濃度，那么會(huì)穩(wěn)定非特異性的結(jié)合，從而導(dǎo)致特異性的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低，并且導(dǎo)致其它PCR假體和背景脫尾的出現(xiàn)。

PCR添加劑

有多種PCR添加劑或者增強(qiáng)劑能改善PCR的結(jié)果。這些試劑通過(guò)解除DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（比如，高GC含量的區(qū)域或者長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物上的二級(jí)結(jié)構(gòu)），降低模板的解鏈溫度，增強(qiáng)酶的續(xù)進(jìn)性，穩(wěn)定DNA聚合酶或者阻止聚合酶黏附到塑料耗材上，發(fā)揮作用。

常用的PCR添加劑包括二甲基亞砜(DMSO)、牛血清蛋白(BSA)和甘油。

簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)和使用準(zhǔn)則

如果靶標(biāo)的精確核苷酸序列未知，則通常可從氨基酸序列推斷PCR引物序列。然而，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，推斷的序列可能在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)變異。在這些情況下，一種常見(jiàn)的解決方法是使用簡(jiǎn)并引物，它是在可變位點(diǎn)由具有不同堿基構(gòu)成的相似引物的混合物。使用簡(jiǎn)并引物可導(dǎo)致PCR測(cè)定優(yōu)化困難：在簡(jiǎn)并引物混合物中僅有有限數(shù)量的引物分子與模板互補(bǔ)；引物序列的解鏈溫度(T_m)可以顯著不同，而某些引物的序列可以與其他引物序列互補(bǔ)。由于這些原因，擴(kuò)增條件必需最大限度地減少非特異性引物–模板和引物–引物相互作用。設(shè)計(jì)和使用簡(jiǎn)并引物時(shí)，以下準(zhǔn)則可能會(huì)有所幫助。

引物序列：

• 避免3'末端3個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)并性，例如，如果可能的話，使用蛋氨酸或色氨酸編碼三聯(lián)體的3'末端
• 為了增加引物–模板的結(jié)合效率，通過(guò)允許引物和模板之間的一些錯(cuò)配以降低簡(jiǎn)并性，特別是對(duì)5'末端，而不是3'末端
• 嘗試在任何給定的位點(diǎn)以小于4倍簡(jiǎn)并性設(shè)計(jì)引物

引物濃度：

• 以0.2 μM引物濃度開(kāi)始進(jìn)行PCR
• 如果PCR效率不高，則以0.25 μM為單位遞增引物濃度直到得到滿意的結(jié)果

長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

使用非特異性的引物退火，未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)條件以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA模板受到損害等都可造成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度超過(guò)3–4 kb。通過(guò)改變各種因素（例如循環(huán)條件、引物和dNTP的濃度以及特殊添加劑等）對(duì)冗長(zhǎng)的序列進(jìn)行優(yōu)化通常是必要的。

優(yōu)化循環(huán)條件

在標(biāo)準(zhǔn)PCR中脫嘌呤化通常不是問(wèn)題，雖然它可以顯著影響長(zhǎng)PCR片段的擴(kuò)增。這是因?yàn)殚L(zhǎng)模板脫嘌呤化比例高于短模板。由于這個(gè)原因，相較于變性步驟為30秒或1分鐘，只有10秒的變性步驟可以得到更高的產(chǎn)率并且無(wú)背景污染（這會(huì)導(dǎo)致PCR失敗）。在最后延伸步驟也觀察到廣泛的脫嘌呤化。因此，延伸溫度為更低的68°C而非72°C時(shí)，可以大幅度提高長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。

長(zhǎng)PCR產(chǎn)物理想的循環(huán)條件請(qǐng)見(jiàn)下表。

長(zhǎng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的循環(huán)條件

* 比引物的Tm低5°C。

步驟	時(shí)間/循環(huán)	溫度
初始活化階段	2 min	95°C
3步循環(huán)
變性	10 s	94°C
退火	1 min	50–68°C*
延伸	1 min/kb
循環(huán)數(shù)	40個(gè)循環(huán)	68°C
PCR循環(huán)結(jié)束	無(wú)限	4°C

優(yōu)化PCR添加劑

發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)往往是由富集GC模板延伸，長(zhǎng)PCR產(chǎn)物高效擴(kuò)增受到干擾造成的。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)添加試劑改變DNA解鏈方式以幫助解決低溫下的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)克服。

優(yōu)化3'到5'核酸外切酶活性

復(fù)制模板時(shí)，相比所謂的標(biāo)定DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶會(huì)引入更多的錯(cuò)配到PCR產(chǎn)物中。一旦在合成過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)配，Taq DNA聚合酶將延伸錯(cuò)配的鏈或脫離模板鏈，從而分別導(dǎo)致突變或PCR產(chǎn)物不完整。雖然這在擴(kuò)增短PCR片段時(shí)通常不會(huì)影響PCR效率，但是長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增可以通過(guò)DNA合成過(guò)程中引入錯(cuò)配而受到顯著影響。

校對(duì)DNA聚合酶包含一種內(nèi)在的3'到5'核酸內(nèi)切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基對(duì)。加入少量的校對(duì)DNA聚合酶到PCR反應(yīng)混合物中，可以顯著提高長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。

用于PCR的酶

數(shù)種類型的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都可在PCR中使用，這里我們提供了酶性質(zhì)的選擇，請(qǐng)參閱表“用于PCR的DNA聚合酶 ”。

分離自真細(xì)菌屬水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶，是標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)定量PCR最常用的酶。這種酶的穩(wěn)健性使其可以在許多不同的PCR測(cè)定中使用。然而，由于這種酶是在室溫下具有活性，其反應(yīng)準(zhǔn)備有必要在冰上進(jìn)行，以避免發(fā)生非特異性擴(kuò)增。

許多原來(lái)的“PCR聚合酶”需要進(jìn)行修飾才能使用，但是現(xiàn)在Taq DNA聚合酶無(wú)需修飾即可用于不同的下游應(yīng)用，如熱啟動(dòng)、單細(xì)胞、高保真或多重PCR。萬(wàn)分之一個(gè)核苷酸的平均錯(cuò)配率使得Taq DNA聚合酶和它的變種的精確度不如B族耐熱DNA聚合酶。但是，由于它的多功能性，Taq DNA聚合酶仍然是當(dāng)涉及到嚴(yán)格的熱啟動(dòng)時(shí)常規(guī)應(yīng)用最多選擇的酶，適用于多種高難度的PCR應(yīng)用。

用于PCR的DNA聚合酶

來(lái)自參考文獻(xiàn)2。

酶的性質(zhì)	DNA聚合酶家族A	DNA聚合酶家族B
可用的酶	Taq DNA聚合酶	校正酶
5'–3'核酸外切酶活性	+	–
3'–5'核酸外切酶活性	–	+
延伸速率（核苷酸/秒）	~150	~25
錯(cuò)配率（per bp/per cycle）	1 in 103/104	1 in 105/106
PCR應(yīng)用	標(biāo)準(zhǔn)、熱啟動(dòng)、逆轉(zhuǎn)錄、real-time	高保真、克隆、定點(diǎn)誘變
A-addition	+	有時(shí)

熱啟動(dòng)DNA聚合酶

在室溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)準(zhǔn)備時(shí)，引物可非特異性地相互結(jié)合，形成引物二聚體。在擴(kuò)增循環(huán)中，引物二聚體可以擴(kuò)展并產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，從而降低了特異性產(chǎn)物的產(chǎn)率。對(duì)于那些高難度的PCR應(yīng)用，熱啟動(dòng)PCR對(duì)特異性結(jié)果至關(guān)重要。為了產(chǎn)生熱啟動(dòng)DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶活性可在較低溫度下用抗體，或者通過(guò)更有效的化學(xué)修飾，與所述聚合酶的氨基酸形成共價(jià)鍵的方式來(lái)進(jìn)行抑制。化學(xué)修飾導(dǎo)致聚合酶完全失活，直到所形成共價(jià)鍵在最初的熱活化步驟被分解。與此相反，抗體介導(dǎo)的熱啟動(dòng)步驟，抗體通過(guò)相對(duì)較弱的非共價(jià)力結(jié)合聚合酶，這使某些聚合酶分子仍處于激活狀態(tài)。這有時(shí)會(huì)導(dǎo)致可在PCR過(guò)程中被進(jìn)一步擴(kuò)增的非特異性引物延伸產(chǎn)物的出現(xiàn)。在瓊脂糖凝膠上電泳時(shí)，這些產(chǎn)物就會(huì)呈現(xiàn)出背景污染或成為尺寸大小不正確的片段。

高保真DNA聚合酶

與標(biāo)準(zhǔn)的DNA聚合酶（如 Taq DNA聚合酶）不同，高保真PCR酶通常具有去除錯(cuò)誤摻入堿基的3'到5'外切酶活性。高保真PCR酶非常適合于要求低錯(cuò)配率，如克隆、測(cè)序和位點(diǎn)定向誘變的應(yīng)用。然而，如果該酶沒(méi)有熱啟動(dòng)功能，3'到5'外切酶活性可以在PCR準(zhǔn)備過(guò)程和PCR的早期階段中降解引物。縮短的引物造成的非特異性引發(fā)將會(huì)導(dǎo)致凝膠上的背景污染或者擴(kuò)增失敗，尤其是當(dāng)所使用模板較少時(shí)。應(yīng)當(dāng)指出的是，校對(duì)功能往往導(dǎo)致高保真酶比其它DNA聚合酶起效更慢。此外，直接UA–或TA–克隆所需的A–addition功能將強(qiáng)烈降低，導(dǎo)致鈍端克隆需要具有較低的連接和轉(zhuǎn)化效率。

PCR循環(huán)

從理論上說(shuō)，在反應(yīng)中每個(gè)PCR循環(huán)將擴(kuò)增子的量擴(kuò)大到兩倍。因此，10個(gè)循環(huán)后的量為約1000因子乘以擴(kuò)增子的量，以此類推。

每個(gè)PCR循環(huán)都包括模板變性、引物退火和引物延伸等階段。如果某個(gè)溫度下退火和延伸是相似的，則這兩個(gè)過(guò)程可以組合。循環(huán)的每個(gè)階段，對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)組合而言，都要對(duì)其反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。

達(dá)到循環(huán)所需數(shù)量之后，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在下游應(yīng)用中被分析或使用。

PCR循環(huán)數(shù)確定準(zhǔn)則

1 kb DNA片段的量	E. coli DNA的量	人類DNA的量	單拷貝基因數(shù)量	PCR循環(huán)數(shù)
0.0.1–0.11 fg	0.05–0.56 pg	36–360 pg	10–100	40–45
0.11–1.1 fg	0.56–5.56 pg	0.36–3.6 ng	100–1000	35–40
1.1–5.5 fg	5.56–278 pg	3.6–179 ng	1 x 103–5 x 104	30–35
>5.5 fg	>278 pg	>179 ng	>5 x 104	25–35

PCR常用術(shù)語(yǔ)

在數(shù)據(jù)分析中使用的基本術(shù)語(yǔ)如下。有關(guān)數(shù)據(jù)分析的更多信息，請(qǐng)參閱real-time PCR廠商建議。數(shù)據(jù)顯示為S形的擴(kuò)增曲線（使用線性標(biāo)度時(shí)），其中熒光值對(duì)循環(huán)數(shù)量繪圖。

之前的目標(biāo)核酸水平可以在real-time PCR中進(jìn)行定量，分析原始數(shù)據(jù)并設(shè)置基線值和閾值。當(dāng)不同的探針被用在單次實(shí)驗(yàn)中（例如當(dāng)平行分析幾個(gè)基因或當(dāng)所使用探針攜帶不同標(biāo)記染料），必須為每個(gè)探針調(diào)整基線與閾值的設(shè)置。

此外，使用SYBR Green檢測(cè)方法分析單次實(shí)驗(yàn)不同的PCR產(chǎn)物時(shí)，需要為每個(gè)單獨(dú)的檢測(cè)調(diào)整基線和閾值。

基線：基線是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測(cè)量，這是因?yàn)樵诖似陂g還檢測(cè)不到擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計(jì)算基線的循環(huán)數(shù)量是可以改變的，如果使用高模板量或者靶標(biāo)基因的表達(dá)水平高則循環(huán)數(shù)量需要減少。設(shè)置基線需要查看線性度擴(kuò)增曲線的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)置基線，使得擴(kuò)增曲線的增長(zhǎng)所開(kāi)始的循環(huán)圈數(shù)大于基線循環(huán)最高圈數(shù)。對(duì)每個(gè)靶標(biāo)序列都需要單獨(dú)設(shè)置基線。早期循環(huán)檢測(cè)到的平均熒光值需要從擴(kuò)增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的最新版本允許單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線設(shè)置。

本底：是指反應(yīng)中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號(hào)的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學(xué)除去。

報(bào)告基因信號(hào) ：在real-time PCR過(guò)程中由SYBR Green或熒光標(biāo)記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。

歸一化報(bào)告信號(hào)（RN）：這是報(bào)告染料熒光強(qiáng)度除以在每個(gè)循環(huán)中測(cè)量的被動(dòng)參照染料的熒光強(qiáng)度。

被動(dòng)參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準(zhǔn)確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。

閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴(kuò)增曲線的平穩(wěn)值。它必須處于擴(kuò)增曲線的線性區(qū)域內(nèi)，代表了PCR檢出的對(duì)數(shù)線性范圍。閾值應(yīng)在對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線視圖中進(jìn)行設(shè)置，以使PCR的對(duì)數(shù)線性期易于識(shí)別。如果real-time PCR中有多個(gè)目標(biāo)基因，閾值必須為每個(gè)目標(biāo)進(jìn)行設(shè)定。

循環(huán)閾值(C_T)或交叉點(diǎn)（CP）：擴(kuò)增曲線穿過(guò)閾值的循環(huán)（即，熒光檢測(cè)值顯著增加的點(diǎn)）。C_T可以是一個(gè)分?jǐn)?shù)，并且可以計(jì)算起始模板量。

ΔC_T值： ΔC_T值描述了靶標(biāo)基因和相應(yīng)的內(nèi)參基因CT值的差值，例如看家基因，并用于標(biāo)準(zhǔn)化模板的使用量：

• ΔC_T = C_T (靶標(biāo)基因) – C_T (內(nèi)源性參比基因)
• ΔΔC_T值：ΔΔC_T值描述了感興趣樣品（例如，刺激細(xì)胞）的平均ΔΔC_T值與參考樣本（例如，未刺激細(xì)胞）的平均ΔΔC_T值之間的差值。參照樣品也被稱為校準(zhǔn)樣品，并且所有其它樣品進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)都將被標(biāo)準(zhǔn)化到如此：
• ΔΔC_T = 平均ΔC_T (感興趣樣品) – 平均ΔC_T (參比樣本)

內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達(dá)水平在樣品間不存在差異，例如看家基因(3)。對(duì)比內(nèi)參基因與靶標(biāo)基因的C_T值可以將靶標(biāo)基因的表達(dá)水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量（見(jiàn)上面關(guān)于ΔC_T值部分）。反應(yīng)中模板的確切數(shù)量不確定。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉(zhuǎn)錄效率、核酸回收和樣品處理的變動(dòng)。為了選出最優(yōu)的參照基因（多個(gè)），我們對(duì)算法進(jìn)行了改進(jìn)，允許其選擇依賴于實(shí)驗(yàn)設(shè)置最優(yōu)參照（4）。

內(nèi)參：在同一反應(yīng)中被作為靶序列擴(kuò)增的，并用不同的探針（即，進(jìn)行雙重PCR）檢測(cè)的對(duì)照序列。內(nèi)參經(jīng)常被用來(lái)排除失敗的擴(kuò)增，例如沒(méi)有檢測(cè)到目標(biāo)序列的情況。

標(biāo)定樣品：在相對(duì)定量中使用的參比樣品（例如，源自細(xì)胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進(jìn)行比較，以確定某一基因的相對(duì)表達(dá)水平。標(biāo)定樣品可以是任何樣品，但通常是一個(gè)對(duì)照品（例如，未處理的樣品或來(lái)自實(shí)驗(yàn)零時(shí)的樣品）。

陽(yáng)性對(duì)照：使用已知量模板的對(duì)照反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照通常用來(lái)檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應(yīng)是否正確設(shè)置。

無(wú)模板對(duì)照（NTC）：包含除模板之外的所有擴(kuò)增反應(yīng)所必要組分的對(duì)照反應(yīng)。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。

無(wú)RT對(duì)照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測(cè)不被設(shè)計(jì)為僅檢測(cè)和擴(kuò)增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測(cè)。DNA污染可以通過(guò)操作在其中沒(méi)有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對(duì)照反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：要生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，C_T值/不同標(biāo)準(zhǔn)稀釋的交叉點(diǎn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)輸入量的對(duì)數(shù)繪圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線通常是使用至少5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍比生成。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標(biāo)準(zhǔn)是各濃度一式三份的理想測(cè)定值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率如果與這些值差異較大則應(yīng)該舍棄。

效率和斜率：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率提供了對(duì)real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該P(yáng)CR具有數(shù)值為1的效率，或100％的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）則表示PCR的效率<1。通常，大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的限制不能達(dá)到100％的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。當(dāng)在反應(yīng)中的非線性期對(duì)值進(jìn)行測(cè)量時(shí)可能發(fā)生這種情況，或者它可以指示是否有抑制劑存在。

real-time PCR檢測(cè)的效率可以通過(guò)分析一個(gè)模板稀釋系列來(lái)計(jì)算，C_T值對(duì)模板量對(duì)數(shù)進(jìn)行繪圖，并確定最終標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。從斜率（S），效率可以用下面的公式計(jì)算：PCR效率(%) = (10(–1/S) – 1) x 100

Real-time PCR

Real-time PCR與RT-PCR（也稱為定量PCR或qPCR）能夠?qū)NA、cDNA和RNA靶標(biāo)的起始數(shù)目進(jìn)行精確定量。該方法在每個(gè)反應(yīng)循環(huán)中對(duì)所發(fā)出的熒光進(jìn)行測(cè)定，隨著反應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍極大地增加，其伴隨產(chǎn)生的熒光與PCR產(chǎn)物之間也成比例的增加。PCR產(chǎn)物能夠通過(guò)與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，或通過(guò)具有熒光標(biāo)記的序列特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。

何為SYBR Green PCR？

SYBR Green I熒光染料能夠結(jié)合雙鏈DNA分子，并伴隨結(jié)合反應(yīng)的發(fā)生在固定波長(zhǎng)發(fā)出熒光信號(hào)。SYBR Green I染料的激發(fā)和發(fā)射光譜分別為494 nm和521 nm，這使得該染料能夠相容任何種類的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)是在real-time PCR的擴(kuò)增期進(jìn)行的。伴隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也由于PCR產(chǎn)物的積累而逐漸增加。使用SYBR Green染料能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)許多不同種類靶標(biāo)的分析，而無(wú)需合成靶標(biāo)特異性的標(biāo)記探針。不過(guò)，非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體也會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。因此，使用SYBR Green染料時(shí)需要高度的PCR反應(yīng)特異性。

何為基于探針的PCR？

熒光標(biāo)記探針提供了一種高靈敏度的檢測(cè)方法，在該方法中只有目的PCR產(chǎn)物才會(huì)得到檢測(cè)。不過(guò)，PCR反應(yīng)的特異性對(duì)于序列特異性探針的使用也同樣重要。擴(kuò)增反應(yīng)中的人為干擾，如非特異性的PCR產(chǎn)物和引物二聚體也可能伴隨性地生成，導(dǎo)致目的PCR產(chǎn)物豐度的降低。特異性產(chǎn)物與反應(yīng)中的人為干擾物之間存在對(duì)反應(yīng)成份的競(jìng)爭(zhēng)，這會(huì)降低分析的效率和靈敏度。以下類型的化學(xué)探針經(jīng)常被使用。

TaqMan探針: 序列特異性的寡聚核苷酸探針，帶有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)偶聯(lián)于探針的5'端，淬滅基團(tuán)則附于3'端。在PCR的結(jié)合退火/鏈延伸期，探針被Taq DNA聚合酶的5'–3'的核酸外切酶活性所切斷，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的分離。從而生成了與積累的PCR產(chǎn)物數(shù)量成比例的可檢測(cè)熒光。.

FRET探針：在使用熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）探針的PCR反應(yīng)中，兩個(gè)已標(biāo)記的寡聚核苷酸探針?lè)謩e以頭尾相接的形式結(jié)合至PCR產(chǎn)物上。當(dāng)兩個(gè)探針同時(shí)結(jié)合到PCR產(chǎn)物上時(shí)，它們的熒光基團(tuán)足夠接近，導(dǎo)致能量從供體熒光基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體熒光基團(tuán)。因此，在PCR反應(yīng)的退火階段能夠產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物數(shù)量成比例的熒光。由于FRET系統(tǒng)中使用了兩條引物和兩條探針，因此良好設(shè)計(jì)的引物和探針的是獲得成功結(jié)果的關(guān)鍵。

在real-time PCR中作為熒光探針的染料：需對(duì)real-time PCR中所使用的序列特異性探針進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，有多種多樣的熒光染料可供選擇，每一種染料都有其特定的激發(fā)峰值和發(fā)射峰值。廣泛可選的染料使得多重real-time PCR技術(shù)成為可能（同一反應(yīng)中檢測(cè)兩個(gè)乃至更多的擴(kuò)增子）：所選擇染料的激發(fā)光譜能夠與實(shí)時(shí)定量PCR儀的檢測(cè)范圍相容（不沖突），而它們的發(fā)射光譜又能夠充分地相互區(qū)別。因此，當(dāng)進(jìn)行多重PCR時(shí)，最好使用波道間距最寬的那些染料，以盡可能避免發(fā)生任何潛在的交互信號(hào)干擾。

其他探針：許多探針供應(yīng)商研發(fā)了他們自主專利的染料。需要更為詳盡的資料，請(qǐng)參閱供應(yīng)商各自的主頁(yè)。

定量real-time PCR中常用的染料

*發(fā)射光譜根據(jù)緩沖條件而變化。

染料	最大激發(fā)光波長(zhǎng)(nm)	最大發(fā)射光波長(zhǎng)(nm)*
熒光素	490	513
Oregon Green	492	517
FAM	494	518
SYBR Green I	494	521
TET	521	538
JOE	520	548
VIC	538	552
Yakima Yellow	526	552
HEX	535	553
Cy3	552	570
Bodipy TMR	544	574
NED	546	575
TAMRA	560	582
Cy3.5	588	604
ROX	587	607
Texas Red	596	615
LightCycler Red 640 (LC640)	625	640
Bodipy 630/650	625	640
Alexa Fluor 647	650	666
Cy5	643	667
Alexa Fluor 660	663	690
Cy 5.5	683	707

PCR定量檢測(cè)

靶標(biāo)核酸可以通過(guò)絕對(duì)定量法或相對(duì)定量法來(lái)進(jìn)行量化。

絕對(duì)定量法能夠確定靶標(biāo)核酸的絕對(duì)數(shù)量（表示為拷貝數(shù)或濃度），而相對(duì)定量法作為分析的第一步，能夠表明靶標(biāo)數(shù)量與參照（例如一個(gè)內(nèi)源性對(duì)照分子，通常為一個(gè)合適的看家基因）數(shù)量之間的比例。之后即可使用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值來(lái)進(jìn)行比較，例如，進(jìn)行不同樣本中不同基因的表達(dá)水平之間的比較。

何為絕對(duì)定量？

使用外部標(biāo)準(zhǔn)將基因表達(dá)水平確定為絕對(duì)拷貝數(shù)值。對(duì)于基因表達(dá)分析，最為精確的標(biāo)準(zhǔn)物是已知拷貝數(shù)或濃度的RNA分子。基于靶標(biāo)的序列和結(jié)構(gòu)以及逆轉(zhuǎn)錄的效率，（通常情況下）RNA樣本中只有一部分靶標(biāo)RNA能夠完成逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中生成的cDNA隨后將在real-time PCR作為反應(yīng)模板。RNA標(biāo)準(zhǔn)品的使用也需要考慮到逆轉(zhuǎn)錄的可變效率。

可以使用5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋產(chǎn)物來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線（C_T值/不同標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的交點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品豐度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行作圖）。未知靶標(biāo)的數(shù)量應(yīng)位于所測(cè)試的區(qū)間內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)稀釋品和靶標(biāo)序列的擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)于獨(dú)立的反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行。首先確定標(biāo)準(zhǔn)品的C_T值。之后將未知樣本的C_T值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，以確定未知樣品中的靶標(biāo)數(shù)量。為需要定量的核酸種類選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品是十分重要的。作為標(biāo)準(zhǔn)品核酸，其拷貝數(shù)或濃度必須已知。此外，標(biāo)準(zhǔn)品還需具備以下特征：

• 引物和探針的結(jié)合位點(diǎn)與需定量的靶標(biāo)一致
• 引物結(jié)合位點(diǎn)之間的序列與靶標(biāo)序列一致或高度相似
• 擴(kuò)增序列的上下游序列與“天然”靶標(biāo)一致或相似
• 標(biāo)準(zhǔn)品和靶標(biāo)分子具有相同的擴(kuò)增效率

用于絕對(duì)定量的RNA標(biāo)準(zhǔn)品

RNA標(biāo)準(zhǔn)品可以通過(guò)將目的轉(zhuǎn)錄本部分或全部地克隆至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)載體中來(lái)獲得。插入片段可以源自總RNA或mRNA樣本的RT-PCR反應(yīng)，或通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA來(lái)獲得。克隆載體必須包含一個(gè)RNA聚合酶的啟動(dòng)子，例如T7、SP6或T3。請(qǐng)確保插入物的體外轉(zhuǎn)錄能夠生成有義鏈轉(zhuǎn)錄本。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，必須使用不含RNase的的DNase降解質(zhì)粒DNA，因?yàn)闅堄嗟馁|(zhì)粒DNA將會(huì)在分光光度測(cè)定RNA濃度的過(guò)程中造成錯(cuò)誤，并在后續(xù)的PCR反應(yīng)中充當(dāng)（錯(cuò)誤的）模板。而且，請(qǐng)?jiān)谀z或毛細(xì)管電泳中驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品RNA作為一單獨(dú)條帶進(jìn)行移動(dòng)，以確保其不含任何降解產(chǎn)物或異常轉(zhuǎn)錄本。

通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度之后，標(biāo)準(zhǔn)RNA分子的拷貝數(shù)可以按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

（X g/μl RNA/[核酸轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度x340]）x6.022x10²³=Y分子個(gè)數(shù)/μl

使用體外轉(zhuǎn)錄物作為RNA標(biāo)準(zhǔn)品的另一替代方法是使用確定的RNA制備物（例如源自細(xì)胞系或病毒的制備物），這類RNA標(biāo)準(zhǔn)品中靶標(biāo)的絕對(duì)濃度是已知的。

用于絕對(duì)定量的RNA標(biāo)準(zhǔn)品

質(zhì)粒DNA：最為常見(jiàn)的建立DNA標(biāo)準(zhǔn)品的方法是向標(biāo)準(zhǔn)載體中克隆一種PCR產(chǎn)物。該法的優(yōu)勢(shì)在于能夠方便地制備大量標(biāo)準(zhǔn)品，其同一性可以通過(guò)測(cè)序進(jìn)行確證，而這些DNA也能夠通過(guò)分光光度測(cè)定法容易地進(jìn)行定量。用于擴(kuò)增的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是靶標(biāo)序列上游或下游的線性化片段，而非超螺旋化質(zhì)粒。這是因?yàn)榫€性化質(zhì)粒的擴(kuò)增效率通常不同于超螺旋化構(gòu)象的質(zhì)粒，前者能夠更好地反映基因組DNA或cDNA的擴(kuò)增效率。

當(dāng)使用分光光度法測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度之后，標(biāo)準(zhǔn)DNA分子的拷貝數(shù)可以按照下列公式進(jìn)行計(jì)算：

（X g/μl DNA/[質(zhì)粒的堿基對(duì)長(zhǎng)度x600]）x6.022x10²³= Y 分子個(gè)數(shù)/μl

PCR片段：包含靶標(biāo)序列的一條PCR產(chǎn)物也可作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品。我們建議使用包含擴(kuò)增子引物結(jié)合位點(diǎn)上下游至少20bp的PCR片段。可直接引用質(zhì)粒DNA的計(jì)算公式（見(jiàn)上），將“質(zhì)粒長(zhǎng)度”換為PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度即可。

基因組DNA：如果感興趣的靶標(biāo)在單倍體基因組僅存一份拷貝，并且假基因和/或高度近似序列的擴(kuò)增可以排除，則基因組DNA也可以作為絕對(duì)定量的DNA標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)使用。如果該物種的基因組大小已知，那么可直接計(jì)算基因組中靶標(biāo)的拷貝數(shù)。例如，小鼠的基因組大小（單倍體）是2.7x10⁹ bp，分子量為1.78x10¹²道爾頓。

那么1.78x10¹² g基因組DNA相當(dāng)于6.022x10²³份單拷貝基因。

1 μg基因組DNA相當(dāng)于3.4x10⁵份單拷貝基因。

何為相對(duì)定量？

在相對(duì)定量中，需要確定靶基因數(shù)量與參比基因（例如一個(gè)在所有樣本中都存在的內(nèi)參基因）數(shù)量之間的比值。該比值隨后被用于不同樣本之間的比較。在基因表達(dá)分析當(dāng)中，看家基因或維持基因通常被選擇作為內(nèi)源性對(duì)照。同一樣本中的靶標(biāo)基因和參比基因，被分開(kāi)進(jìn)行擴(kuò)增，或在同一反應(yīng)中被共同擴(kuò)增（多重real-time PCR）。對(duì)每一個(gè)樣本確定標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值，舉例來(lái)說(shuō)，該標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值能夠用于比較同一基因在不同組織中的差異表達(dá)情況，或?qū)iRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。不過(guò)，內(nèi)參基因的表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)條件或不同組織狀態(tài)（例如“受刺激”與“未刺激”樣本）中不能發(fā)生變化。當(dāng)比較樣本之間的基因表達(dá)水平時(shí)，受刺激細(xì)胞中靶標(biāo)的表達(dá)水平可能相對(duì)于未刺激細(xì)胞高出100倍（舉例來(lái)說(shuō)）。靶標(biāo)和內(nèi)參基因以同等或不等的效率完成擴(kuò)增，定量的結(jié)果將會(huì)不同。

測(cè)定擴(kuò)增效率

兩個(gè)基因（靶點(diǎn)A和B）的擴(kuò)增效率可以通過(guò)從參考RNA或cDNA制備兩個(gè)基因的梯度稀釋樣品來(lái)進(jìn)行比較。每一梯度稀釋樣品都通過(guò)一步或兩步法的real-time RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并以獲得的CT值建立關(guān)于靶點(diǎn)A和B的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每一靶點(diǎn)的擴(kuò)增效率（E）可以按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

E = 10^(–1/S) – 1 (S=標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)

為了比較兩個(gè)靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率，使用靶點(diǎn)B的C_T值減去靶點(diǎn)A的C_T值。再以C_T值之間的差值相對(duì)于模板量的對(duì)數(shù)進(jìn)行作圖。如果得到的直線斜率小于0.1，則可視為擴(kuò)增效率相當(dāng)。

不同的擴(kuò)增效率

靶基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率通常是不同的，因?yàn)閮烧咧g的引物退火效率，所擴(kuò)增序列的GC含量以及PCR產(chǎn)物大小通常都存在差異。在這種情況下，例如使用對(duì)照細(xì)胞系的總RNA（標(biāo)定或參考樣品）時(shí)，需同時(shí)對(duì)靶基因和內(nèi)參基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由于PCR效率之間存在區(qū)別，因此所得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線將不會(huì)平行，即當(dāng)模板量變化時(shí)，靶基因與參考基因之間的C_T值差異不會(huì)為常數(shù)。

不同擴(kuò)增效率下的相對(duì)定量指南：

• 選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因，其表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)條件下或不同組織之間不應(yīng)發(fā)生變化。
• 制備cDNA或RNA對(duì)照樣本的倍比稀釋樣品（例如5或10倍的稀釋比例），以建立靶基因和參考基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
• 進(jìn)行real-time PCR/RT-PCR反應(yīng)。
• 確定標(biāo)準(zhǔn)品和目的樣品的C_T值。
• 通過(guò)將C_T值（Y軸）相比模板量或稀釋品的對(duì)數(shù)值（X軸）進(jìn)行繪圖，為靶基因和參考基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
• 使用C_T值及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中靶基因和參考基因的數(shù)量。
• 將靶基因的豐度值除以參考基因的豐度值，以對(duì)靶基因的數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（如果反應(yīng)重復(fù)多次，則應(yīng)使用平均值）。
• 定義校驗(yàn)樣本，并將靶基因的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量除以校驗(yàn)樣本的對(duì)應(yīng)數(shù)值，來(lái)比較樣品中靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。

相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率

如果靶基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相當(dāng)，則只對(duì)參考基因建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可。在這種條件下，當(dāng)模板數(shù)量變化時(shí)，靶基因與參考基因之間C_T值的差異為一個(gè)常數(shù)。未知樣本中靶基因與參考基因的豐度，通過(guò)將C_T值與參考基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算。

相當(dāng)擴(kuò)增效率下的相對(duì)定量指南：

• 選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因，其表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)條件下或不同組織之間不應(yīng)發(fā)生變化。
• 制備cDNA或RNA對(duì)照樣本的倍比稀釋樣品（例如5或10倍的稀釋比例），僅為內(nèi)參基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
• 進(jìn)行real-time PCR/RT-PCR反應(yīng)。
• 確定標(biāo)準(zhǔn)品和目的樣品的C_T值。
• 將C_T值（Y軸）相比模板或稀釋樣品豐度的對(duì)數(shù)值（X軸）進(jìn)行作圖，為內(nèi)參基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
• 使用C_T 值及標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中靶基因和參考基因的數(shù)量。
• 將靶基因的豐度值除以參考基因的豐度值，以對(duì)靶基因的數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（如果反應(yīng)重復(fù)多次，則應(yīng)使用平均值）。
• 定義標(biāo)定樣本，并將靶基因的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量除以校驗(yàn)樣本的對(duì)應(yīng)數(shù)值，來(lái)比較樣品中靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。

相對(duì)定量的比較法或ΔΔC_T法

另一種替代方法稱為比較或ΔΔC_T法，該法基于對(duì)C_T值的直接比較。在初始實(shí)驗(yàn)中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線只為確定靶基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。在所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需為靶標(biāo)序列建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果擴(kuò)增效率相同，靶點(diǎn)的數(shù)量只需簡(jiǎn)單使用C_T值，以如下方法進(jìn)行計(jì)算。

首先，通過(guò)計(jì)算靶基因與內(nèi)參基因C_T值之間的差值來(lái)確定每個(gè)樣品的ΔC_T值。每一未知樣本及校驗(yàn)樣本都需要確定該值。

• ΔC_T (樣本) = C_T靶基因– C_T 參比基因
• ΔC_T (校驗(yàn)樣本) = C_T 靶基因– C_T 參比基因

之后，通過(guò)使用樣本的ΔC_T值減去校驗(yàn)樣本的ΔC_T值，獲得每一樣本的ΔΔC_T值。

• ΔΔC_T = ΔC_T (樣本) – ΔC_T (校驗(yàn)樣本)

如果靶基因與內(nèi)參基因之間的PCR效率相同，則靶基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化值可通過(guò)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

• 樣品中靶基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平= 2^–ΔΔCT

不過(guò)，如果靶基因與內(nèi)參基因之間的PCR效率不同，則該定量方法會(huì)導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)水平的錯(cuò)誤估計(jì)。

該誤差值是關(guān)于PCR效率與循環(huán)數(shù)的一個(gè)函數(shù)，可通過(guò)下列公式進(jìn)行計(jì)算：

• 誤差(%) = [(2ⁿ/(1+E)ⁿ) x 100)] – 100 (where E = PCR效率; n =循環(huán)數(shù))

因此，如果PCR的效率不是1而是0.9，則25個(gè)循環(huán)之后結(jié)果誤差可達(dá)261%。計(jì)算出的基因表達(dá)水平將比實(shí)際值低3.6倍。

小貼士： ΔΔC_T法僅適于靶基因與內(nèi)參基因的PCR效率相同時(shí)使用，或在基因表達(dá)水平之間的差異足夠大，可容忍結(jié)果誤差的情況下使用。不過(guò)，該誤差也可使用如Relative Expression Software Tool（REST；參見(jiàn)參考文獻(xiàn)5）一類的效率校正計(jì)算程序進(jìn)行修正。

使用ΔΔC_T 法進(jìn)行相對(duì)定量的指南：

• 進(jìn)行有效性試驗(yàn)，以確定靶基因和參考基因的PCR效率。
• 對(duì)源自不同樣本的RNA中的靶基因和參考基因進(jìn)行real-time RT-PCR。
• 通過(guò)將每一樣本中靶基因的C_T值減去內(nèi)參基因CT值，以獲得ΔC_T值。
• 定義校驗(yàn)樣品，通過(guò)使用每一樣品的ΔC_T值減去校驗(yàn)樣品的ΔC_T值，以獲得ΔΔC_T值。
• 使用公式2^–ΔΔCT，來(lái)計(jì)算檢測(cè)樣品相對(duì)校驗(yàn)樣本的靶基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值。

內(nèi)源性參比基因

為了對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，需要選取一個(gè)合適的基因做為對(duì)照。參比基因的表達(dá)水平應(yīng)該在不同的實(shí)驗(yàn)條件或者相同組織和細(xì)胞系的不同狀態(tài)下（比如，在疾病樣本和正常樣本中）維持恒定。對(duì)照RNA的表達(dá)水平應(yīng)該與被研究的RNA大體一致。對(duì)照RNA經(jīng)常用于相對(duì)定量檢測(cè)?–肌動(dòng)蛋白、?–2–微球蛋白、親環(huán)蛋白A，GAPHD mRNA和18S rRNA等。廣泛表達(dá)的?–肌動(dòng)蛋白mRNA，是最早被用做參比基因的RNA之一。但是，它的轉(zhuǎn)錄水平可能會(huì)改變，并且由于假基因的存在，導(dǎo)致在real-time PCR中會(huì)檢測(cè)到基因組DNA，從而使得定量檢測(cè)不準(zhǔn)確。GAPDH是一種看家基因，經(jīng)常被用做基因表達(dá)定量檢測(cè)的參比基因。GAPDH的mRNA的表達(dá)水平可能在不同的個(gè)體，細(xì)胞周期的不同階段以及不同藥物處理之后有差別，這使得GAPDH在有些體系中不適合用做參比基因。由于18S rRNA不是mRNA，它的表達(dá)水平不能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)mRNA的數(shù)量。因此組合各種基因才有可能給定量檢測(cè)研究提供可靠的參照。

常用做內(nèi)參基因的看家基因

* “+”轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。

基因	人類基因符號(hào)	小鼠基因符號(hào)	人類的相對(duì)表達(dá)水平*	小鼠的相對(duì)表達(dá)水平*
18S ribosomal RNA	RRN18S	Rn18s	++++	++++
Actin, beta	ACTB	Actb	+++	+++
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	GAPDH	Gapdh	+++	+++
Phosphoglycerate kinase 1	PGK1	Pgk1	+++	+++
Peptidylprolyl isomerase A	PPIA	Ppia	+++	+++
Ribosomal protein L13a	RPL13A	Rpl13a	+++	+++
Ribosomal protein, large, P0	RPLP0	–	+++	–
Acidic ribosomal phosphoprotein PO	–	Arbp	–	+++
Beta-2-microglobulin	B2M	B2m	++ to +++	++ to +++
Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide	YWHAZ	Ywhaz	++ to +++	+
Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp)	SDHA	Sdha	++	+
Transferrin receptor	TFRC	Tfrc	++	+
Aminolevulinate, delta-, synthase 1	ALAS1	Alas1	+	+
Glucuronidase, beta	GUSB	Gusb	+	+
Hydroxymethylbilane synthase	HMBS	Hmbs	+	++ to +++
Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1	HPRT1	Hrpt1	+	+
TATA box binding protein	TBP	Tbp	+	+
Tubulin, beta	TUBB	–	+	–
Tubulin, beta 4	–	Tubb4	–	+

PCR對(duì)照

無(wú)模板對(duì)照

無(wú)模板對(duì)照(NTC)可以檢測(cè)PCR試劑是否被污染。一次NTC反應(yīng)中包含了real-time PCR中除模板之外的所有成分。在NTC反應(yīng)中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)說(shuō)明存在核酸污染物。

陽(yáng)性對(duì)照l(shuí)

陽(yáng)性對(duì)照很有必要，比如，在擴(kuò)增一個(gè)新的目標(biāo)序列時(shí)，它可用于確定引物集或者引物–探針集是否有效。陽(yáng)性對(duì)照可以是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品（即明確知道核酸模板的拷貝數(shù)目），以提供定量檢測(cè)的信息。從穩(wěn)定細(xì)胞系中獲得的核酸、包含克隆序列的質(zhì)粒或者體外轉(zhuǎn)錄的RNA等絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得或者在實(shí)驗(yàn)室中制備。陽(yáng)性對(duì)照也可以是一個(gè)已知的陽(yáng)性樣本，通常用做絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代物，并且僅用于檢測(cè)靶標(biāo)存在與否。

無(wú)RT對(duì)照

在進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，應(yīng)該包含無(wú)RT對(duì)照實(shí)驗(yàn)。無(wú)RT對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指，在做real-time PCR時(shí)不加入逆轉(zhuǎn)錄酶。對(duì)于病毒載量監(jiān)測(cè)，根據(jù)樣本的類型和該病毒物種的生命周期，無(wú)RT對(duì)照可能是必需的。由于無(wú)RT對(duì)照中，逆轉(zhuǎn)錄不可能發(fā)生，因此，無(wú)RT對(duì)照反應(yīng)可以檢測(cè)到DNA污染物，比如整合到宿主基因組中的病毒DNA序列。可以在RT-PCR之前，用脫氧核糖核酸酶處理樣本，以除去RNA樣本中的DNA雜質(zhì)。

內(nèi)質(zhì)控

內(nèi)在陽(yáng)性對(duì)照可以檢測(cè)到是否有PCR抑制劑存在。進(jìn)行一次雙重PCR反應(yīng)，在這個(gè)反應(yīng)中，目標(biāo)序列使用一種引物–探針集擴(kuò)增，而對(duì)照序列（即內(nèi)部、陽(yáng)性對(duì)照）用其他引物–探針集擴(kuò)增。為了得到精確的檢測(cè)結(jié)果，內(nèi)在陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該使用足夠多的拷貝數(shù)目。如果能檢測(cè)到內(nèi)在陽(yáng)性對(duì)照的產(chǎn)物，但是卻檢測(cè)不到目標(biāo)序列，則說(shuō)明擴(kuò)增反應(yīng)是成功的，目標(biāo)序列并不存在（或者拷貝數(shù)目太低，不能被檢測(cè)到）。

有若干因素會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，比如樣本提取錯(cuò)誤或者熱循環(huán)儀故障。由于PCR或者RT-PCR被抑制導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗是最常見(jiàn)的情況。

檢測(cè)抑制子是否存在的最可行方法是使用內(nèi)在陽(yáng)性對(duì)照或內(nèi)質(zhì)控（IC）。內(nèi)質(zhì)控與待測(cè)病原體在同一離心管中同時(shí)純化和擴(kuò)增（或僅被擴(kuò)增），并且應(yīng)與外部陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)使用，以證明待測(cè)病原體擴(kuò)增的反應(yīng)混合液沒(méi)有異常。內(nèi)質(zhì)控和外部陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)合使用可排除抑制子因素，確保得到的陰性結(jié)果是準(zhǔn)確的。

內(nèi)質(zhì)控有多種類型，每種適用于不同應(yīng)用。內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)控在待測(cè)樣本中自然存在，例如宿主基因組中的一段序列（如β–actin）或是正常菌群基因組中的一段序列（如16s）。而外源性內(nèi)質(zhì)控是在核酸純化時(shí)或進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前加入樣本中的。

外源性內(nèi)質(zhì)控可以是同源的，人工構(gòu)建的模板，具有一段和待測(cè)病原體相同的引物核酸序列。盡管使用相同的引物，但待測(cè)病原體和內(nèi)質(zhì)控序列不同，因此可使用不同的探針區(qū)分病原體和內(nèi)質(zhì)控?cái)U(kuò)增子。而異源內(nèi)質(zhì)控是使用針對(duì)性的引物和探針檢測(cè)的。

內(nèi)源性和外源性同源內(nèi)質(zhì)控會(huì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)物，因此可能會(huì)影響檢測(cè)待測(cè)病原體的靈敏度。例如，高起始濃度的內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)控模板會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。起始濃度高可能是由特定樣本類型或取樣技術(shù)導(dǎo)致的。進(jìn)行RNA相關(guān)研究時(shí)，可能是致病病原體過(guò)度導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)控的高表達(dá)。對(duì)于外源性同源內(nèi)質(zhì)控，因使用相同引物同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)病原體和內(nèi)質(zhì)控，導(dǎo)致二者競(jìng)爭(zhēng)引物。此外，內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)控和同源內(nèi)質(zhì)控設(shè)計(jì)上具有冗余序列，所以僅適用于個(gè)別檢測(cè)和應(yīng)用。

至于操作安全性和工作流程簡(jiǎn)潔性，外源性異源內(nèi)質(zhì)控應(yīng)用最靈活、可提供最多信息。內(nèi)質(zhì)控模板量是已知且統(tǒng)一的，并且其設(shè)計(jì)不受限制，可對(duì)各項(xiàng)屬性進(jìn)行優(yōu)化。只有使用外源性異源內(nèi)質(zhì)控才可防止PCR反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)，并且異源內(nèi)質(zhì)控可作為通用對(duì)照，便利的用于新檢測(cè)。

內(nèi)質(zhì)控的特點(diǎn)

特點(diǎn)	外源性同源	外源性異源	內(nèi)源性
通用于多種assays	否	是	否
作為純化的對(duì)照	是	是	是
區(qū)分純化錯(cuò)誤和擴(kuò)增錯(cuò)誤	是	是	否
模板量已知且一致	是	是	否
非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)質(zhì)控設(shè)計(jì)	否	是	是

PCR類型

多重PCR

多重PCR在同一個(gè)反應(yīng)中使用不同的引物對(duì)，以同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。這種類型的PCR通常需要充分優(yōu)化退火條件，以便對(duì)不同的引物–模板系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)最高效率的擴(kuò)增。這種類型的PCR經(jīng)常受到非特異性PCR產(chǎn)物的影響。嚴(yán)格的熱啟動(dòng)程序和特別優(yōu)化的緩沖溶液系統(tǒng)對(duì)于成功的多重PCR絕對(duì)是非常關(guān)鍵的。

與僅使用兩個(gè)引物的標(biāo)準(zhǔn)PCR系統(tǒng)相比較，多重PCR所面對(duì)的另外一個(gè)挑戰(zhàn)是，不同的引物對(duì)之間，雜交動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不同。結(jié)合效率更高的引物能更充分的利用PCR反應(yīng)試劑，從而導(dǎo)致其它PCR產(chǎn)物的減少。這通常會(huì)導(dǎo)致一些本應(yīng)該被擴(kuò)增的產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)。有一些商業(yè)化的試劑盒經(jīng)過(guò)特別的設(shè)計(jì)，可以避免這種情況，條件允許時(shí)，建議盡量使用這一類試劑盒。

長(zhǎng)片段PCR

低于4 kb長(zhǎng)的序列可以使用Taq DNA聚合酶和標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。但是，擴(kuò)增長(zhǎng)度大于4 kb的序列，如果沒(méi)有經(jīng)過(guò)長(zhǎng)度優(yōu)化，通常會(huì)失敗。失敗的原因包括非特異性引物退火，DNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及不理想的循環(huán)條件——所有這些因素對(duì)于長(zhǎng)片段擴(kuò)增的影響要遠(yuǎn)大于對(duì)短片段擴(kuò)增的影響。防止DNA損傷，比如DNA脫嘌呤作用，對(duì)于長(zhǎng)片段的擴(kuò)增是非常重要的，這是因?yàn)槟０錎NA上的一個(gè)單獨(dú)的損害就足以使PCR酶反應(yīng)停頓。可以使用特別的緩沖試劑，穩(wěn)定反應(yīng)的pH值，以將DNA在PCR循環(huán)中所受到的損害將到最低。一些商業(yè)化PCR試劑盒經(jīng)過(guò)特別的設(shè)計(jì)，比如，使用優(yōu)化過(guò)的Taq DNA聚合酶和校正讀碼酶的混合物，從而可以克服長(zhǎng)片段PCR所面對(duì)的問(wèn)題。條件允許時(shí)，建議盡量使用這一類試劑盒。

單細(xì)胞PCR

單細(xì)胞PCR是一種使用有限的起始材料進(jìn)行基因鑒定的有價(jià)值的工具。通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)或者顯微操作技術(shù)，能夠根據(jù)細(xì)胞表面的標(biāo)志物或者其物理形態(tài)，將感興趣的單個(gè)細(xì)胞分離出來(lái)。低豐度模板分子擴(kuò)增——有時(shí)候僅有一到兩個(gè)基因拷貝——要求PCR系統(tǒng)具有非常高的效率、特異性和靈敏性。同樣，市面上也有一些特別設(shè)計(jì)的針對(duì)單細(xì)胞PCR的商業(yè)化PCR試劑盒。

快速循環(huán)PCR

快速PCR擴(kuò)增可以提高PCR的通量，使得研究者能將更多的時(shí)間用在下游的分析上。最新的快速PCR技術(shù)方面的發(fā)展縮短了得到結(jié)果所需要的時(shí)間。使用具有更高溫度變化速率的熱循環(huán)儀或者使用能顯著縮短DNA變性、引物退火和DNA延伸所需的時(shí)間的新PCR試劑，以縮短循環(huán)時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)快速PCR。快速循環(huán)PCR試劑必須經(jīng)過(guò)高度的優(yōu)化，以保證擴(kuò)增的特異性和靈敏性。

甲基化特異性PCR（MSP）

在MSP中，使用亞硫酸氫鈉處理目標(biāo)DNA，然后使用MSP確定其甲基化狀態(tài)。這種方法需要設(shè)計(jì)兩種引物集：一種引物集與未改變的胞嘧啶結(jié)合（即基因組DNA中甲基化的胞嘧啶），另外一種引物集與脲嘧啶結(jié)合，這些脲嘧啶是基因組DNA中未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理轉(zhuǎn)化形成的。與未改變的序列配對(duì)的引物所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明其上的胞嘧啶是被甲基化了的，因此在用亞硫酸氫鹽的處理時(shí)沒(méi)有被改變。

必須使用嚴(yán)格的和高度特異性的PCR條件以避免非特異性引物結(jié)合以及人為的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由于將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成脲嘧啶降低了DNA的復(fù)雜性并且增強(qiáng)了引物–模板的非特異性結(jié)合，因此這一點(diǎn)非常重要。

熱啟動(dòng)PCR

參見(jiàn)“熱啟動(dòng)DNA聚合酶”了解更多的信息。

高保真PCR

參見(jiàn)“高保真DNA聚合酶”了解更多的信息。

RAPD：快速擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析

RAPD是一種基于PCR的，分子水平生物體研究工具。這種方法使用小的，非特異性引物擴(kuò)增基因組DNA上看似隨機(jī)的區(qū)域。在使用瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，成功的引物對(duì)在不同的個(gè)體，菌種和物種上所得到的PCR產(chǎn)物，顯示不同的條帶模式。

在RAPD實(shí)驗(yàn)中，引物的長(zhǎng)度僅有10個(gè)堿基左右。因此，退火溫度需要低于40°C。

RACE：cDNA末端的快速擴(kuò)增

RACE是RT-PCR技術(shù)的一個(gè)變體，用來(lái)擴(kuò)增mRNA模板的一個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)與其3’或5’末端之間的未知序列。RACE僅需要知道目標(biāo)mRNA上的一段短的序列。這種技術(shù)通常用來(lái)克隆不完整的cDNA分子的剩余部分。有兩種RACE技術(shù)：

• 5' RACE——擴(kuò)增cDNA的5'末端
• 3' RACE ——擴(kuò)增cDNA的3'末端

兩種RACE技術(shù)的第一步一樣，都是使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化成單鏈的cDNA。區(qū)別在于第二步不同，兩種技術(shù)所得到的信息可以用來(lái)得到完整的cDNA序列。

由于RACE使用mRNA中的一個(gè)錨定位點(diǎn)作為參考位點(diǎn)，它有時(shí)候也被稱作“錨定PCR”。

原位PCR

原位PCR技術(shù)是在玻片上的細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行的PCR反應(yīng)，這種技術(shù)綜合了PCR或者RT-PCR擴(kuò)增的靈敏性與原位雜交技術(shù)。原位PCR技術(shù)能確定細(xì)胞的標(biāo)志物并進(jìn)一步定位細(xì)胞群中（比如組織或者血液樣本中）的細(xì)胞特異性序列。因此，原位PCR是研究疾病進(jìn)展的強(qiáng)有力的工具。

在這種技術(shù)中，新鮮的和固定的細(xì)胞和組織樣本都能用，但是樣本制備對(duì)結(jié)果非常關(guān)鍵，并且細(xì)胞的固定對(duì)PCR信號(hào)有直接的影響。這種技術(shù)適合使用放射性標(biāo)記的，熒光標(biāo)記的或者生物素標(biāo)記的核酸探針。

PCR的過(guò)程本質(zhì)上與標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程相同，但是需要修改一些反應(yīng)條件（比如Mg²⁺濃度）。

差異顯示PCR

差異顯示PCR是一種基于RT-PCR的技術(shù)，用來(lái)比較并確定兩個(gè)細(xì)胞系或者細(xì)胞群中mRNA（也就是基因）的表達(dá)模式的差異。

在這種技術(shù)中，通過(guò)使用與mRNA的poly(A)尾處的13個(gè)核苷酸以及轉(zhuǎn)錄序列上與之相鄰的兩個(gè)核苷酸互補(bǔ)的引物，引導(dǎo)第一條cDNA鏈合成。經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和序列擴(kuò)增之后，使用凝膠電泳觀測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)比較兩個(gè)細(xì)胞群的不同條帶模式，確定其所表達(dá)的cDNA的差異。

這種技術(shù)發(fā)明于20世紀(jì)90年代，并迅速成為基因表達(dá)分析領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。但是最近這種技術(shù)更多的被RNA-seq、微陣列技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)所取代。

RT-PCR準(zhǔn)則

在進(jìn)行real-time RT-PCR時(shí)，必須仔細(xì)的選擇逆轉(zhuǎn)錄的酶和引物。引物要能逆轉(zhuǎn)錄所有感興趣的并且，并且逆轉(zhuǎn)錄酶所得到的cDNA的量必須能精確的反映原始RNA量，以便能精確定量檢測(cè)。除此之外，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的成分對(duì)于后續(xù)的real-time PCR反應(yīng)的影響要達(dá)到最小。

為以RNA為起始模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，必須通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT和PCR可以在同一個(gè)試管中相繼完成（一步法RT-PCR），也可以分開(kāi)完成（兩步法RT-PCR）。一步法RT-PCR需要基因特異性的引物。

Real-time RT-PCR可以通過(guò)一步法或者兩步法完成。在兩步法PCR中，首先使用寡聚dT引物、隨機(jī)的寡聚物，或者基因特異性的引物，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物分成若干等分，加入到real-time PCR反應(yīng)中。可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，選擇不同類型的RT引物。使用寡聚dT引物或者隨機(jī)的寡聚物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，意味著可以通過(guò)一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物，對(duì)幾個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分析。除此之外，珍貴的RNA樣本可以立刻轉(zhuǎn)錄成更加穩(wěn)定的cDNA，以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)或者長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

在一步法RT–PC反應(yīng)中——也被稱為單管RT-PCR反應(yīng)——逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR在同一個(gè)試管中進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)先于PCR反應(yīng)。特別的反應(yīng)試劑和循環(huán)方案使之成為可能。快速的流程可以迅速的處理多個(gè)樣本，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。操作步驟的減少提高了不同樣本結(jié)果的可重復(fù)性，并且由于減少了操作，降低了樣本被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

不同的RT-PCR操作流程的優(yōu)勢(shì)

操作	優(yōu)勢(shì)
兩步法RT-PCR	多重PCR進(jìn)行一個(gè)RT反應(yīng) RT引物選擇靈活 可長(zhǎng)期儲(chǔ)存cDNA
一步法RT-PCR	操作簡(jiǎn)便 流程快速 可重復(fù)性高 污染可能性小

RT引物的選擇

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)選取什么樣的引物取，決于進(jìn)行的是一步法還是兩步法RT-PCR。在一步法RT-PCR中，下游PCR反應(yīng)的引物即為逆轉(zhuǎn)錄的引物。因此，一步法RT-PCR一定要使用基因特異性引物。在兩步法RT-PCR中，可以使用三種不同類型的引物以及它們的混合物，它們分別是寡聚dT引物（通常包含13–18個(gè)核苷酸），隨機(jī)的寡聚物（比如六聚物，八聚物或者九聚物），或者基因特異性的引物。如果使用寡聚dT引物，僅mRNA能從其3'末端的poly–A的尾巴處逆轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)的寡聚物能夠逆轉(zhuǎn)錄所有的RNA，包括核糖體RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，和核內(nèi)小分子RNA。由于逆轉(zhuǎn)錄是從RNA分子中間的某些位點(diǎn)上開(kāi)始的，因此，這將得到相對(duì)較短的cDNA分子。而基因特異性的引物可以逆轉(zhuǎn)錄某一特定轉(zhuǎn)錄本。

兩步法real-time RT-PCR中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，采用通用引物應(yīng)該就能高靈敏度、可重復(fù)的擴(kuò)增和檢測(cè)任何PCR產(chǎn)物，不受長(zhǎng)度和擴(kuò)增子的位置限制。

RT-PCR應(yīng)用中引物類型的適用性

應(yīng)用	推薦的引物類型
特定轉(zhuǎn)錄本的RT-PCR	基因特異性的引物具有最高的靈敏性，并且只逆轉(zhuǎn)錄所選定的RNA分子
長(zhǎng)擴(kuò)增子的RT-PCR	寡聚dT引物或者基因特異性引物
長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本中的擴(kuò)增子的RT-PCR	推薦基因特異性引物，隨機(jī)的寡聚物，或者寡聚dT引物和隨機(jī)九聚體的混合物，這樣可以得到覆蓋完整轉(zhuǎn)錄本的cDNA

兩步法RT-PCR的條件

加入到兩步法RT-PCR中的RT反應(yīng)溶液的體積的影響

在兩步法RT-PCR中，加入到后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液中的，不僅包含了cDNA，還包含了鹽、dNTP和逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液，與real-time PCR緩沖液的鹽成分不同，因此會(huì)損害real-time PCR的效果。但是，如果RT反應(yīng)溶液的體積占最終的real-time PCR體積的10%或者更少，這種損害就不那么明顯。如果20 μl的PCR反應(yīng)溶液中包含了3 μl的RT反應(yīng)溶液（即總體積的15%），那么real-time PCR反應(yīng)就會(huì)被顯著抑制。我們建議測(cè)試下逐漸稀釋的RT反應(yīng)溶液對(duì)real-time PCR反應(yīng)的影響，以確定這種影響的線性關(guān)系。這可以幫助消除RT反應(yīng)混合物對(duì)PCR的抑制作用，以免影響對(duì)轉(zhuǎn)錄本的精確定量檢測(cè)。

RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)能從幾個(gè)不同的方面影響RT-PCR。具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA區(qū)域會(huì)終止逆轉(zhuǎn)錄酶的作用或者使其從RNA模板上解離出來(lái)。

截?cái)嗟腸DNA片段由于缺失下游的引物結(jié)合位點(diǎn)，不能被PCR反應(yīng)所擴(kuò)增。而逆轉(zhuǎn)錄酶可能跳過(guò)RNA的環(huán)狀區(qū)域，這樣，在合成的cDNA中就不包含這段序列。在PCR反應(yīng)中，這些缺失中間序列的cDNA被擴(kuò)增，并產(chǎn)生了縮短的PCR產(chǎn)物。理想狀況下，逆轉(zhuǎn)錄酶應(yīng)該不受RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并且能夠逆轉(zhuǎn)錄任何模板，而不需要反應(yīng)優(yōu)化。

如果序列中的GC含量較高，那么RNA：DNA所形成的雜交物會(huì)結(jié)合的非常緊密，并且會(huì)影響PCR反應(yīng)中的引物結(jié)合，阻止DNA聚合酶的作用。RNase H可以去除RNA：DNA雜交物中的RNA，方便引物結(jié)合和第二條DNA鏈合成。以前的研究顯示，RNase H能夠改善RT-PCR的產(chǎn)量，并且對(duì)于擴(kuò)增某些序列是必須的——即使是157 bp的短序列（7）。

一步法RT-PCR的條件

一步法RT-PCR中理想的逆轉(zhuǎn)錄酶，應(yīng)該與前述兩步法RT-PCR中的逆轉(zhuǎn)錄酶有相同的性質(zhì)。但是一步法RT-PCR中的一個(gè)主要問(wèn)題是，逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)于PCR反應(yīng)的抑制作用。這會(huì)導(dǎo)致C_T值增大，從而使得其靈敏性和特異性不如兩步法RT-PCR。

RT-PCR引物設(shè)計(jì)

RT-PCR中的一個(gè)關(guān)鍵因素是，選擇合適的引物以達(dá)到最高的效率和最大的特異性。引物的特異性受到很多因素的影響，包括序列、引物的位置和使用的RT-PCR體系。常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)規(guī)則也適用于RT-PCR，可避免錯(cuò)誤引導(dǎo)或者引物二聚體的形成。這些設(shè)計(jì)規(guī)則在RT-PCR中可能更加重要，這是由于逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA是單鏈，更容易與引物非特異性結(jié)合。RT-PCR反應(yīng)中，引物非特異性的結(jié)合會(huì)降低反應(yīng)的靈敏度，導(dǎo)致特定產(chǎn)物減少，甚至整個(gè)RT-PCR反應(yīng)失敗。

為了避免擴(kuò)增基因組DNA，可以這樣設(shè)計(jì)RT-PCR的引物：引物的一端與一個(gè)外顯子的3’端雜交，另一端與相鄰?fù)怙@子的5’端雜交。這樣的引物在退火時(shí)，與剪接后的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA雜交，而不與基因組DNA雜交。

為了測(cè)定DNA污染物是否被擴(kuò)增了，在設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，應(yīng)使其覆蓋的區(qū)域包含至少一個(gè)內(nèi)含子。從cDNA（不包含內(nèi)含子）擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，比從基因組DNA（包含內(nèi)含子）擴(kuò)增得到的產(chǎn)物要短。產(chǎn)物尺寸上的差別可以檢測(cè)DNA污染物是否存在。

如果僅mRNA序列已知，請(qǐng)選擇相隔至少300–400 bp核的引物退火位點(diǎn)。因?yàn)檎婧薉NA上，這種尺度的片段可能包含剪接位點(diǎn)。如前所述，這樣的引物可以用來(lái)檢測(cè)DNA污染物存在與否。

總的說(shuō)來(lái)，在設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，需要考慮如下因素：

• 退火溫度會(huì)影響RT-PCR的效率和靈敏性。
• 高引物濃度會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引導(dǎo)和引物二聚體的形成。
• 嚴(yán)格的熱啟動(dòng)流程對(duì)于得到最佳的RT-PCR結(jié)果的必備條件。
• RT-PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)使其能夠區(qū)別出RNA和DNA污染物的信號(hào)。為了得到最好的結(jié)果，應(yīng)該使用不含DNA的RNA以避免RT-PCR反應(yīng)中DNA參與競(jìng)爭(zhēng)。

RT-PCR中使用的酶

RT-PCR將逆轉(zhuǎn)錄和PCR聯(lián)合起來(lái)，以分析RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA——RNA依賴的DNA聚合酶，通常從多種逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取出來(lái)（比如禽類成髓細(xì)胞瘤病毒 [AMV]或者莫洛尼鼠類白血病病毒 [MMLV] ）。

盡管熱力學(xué)穩(wěn)定的DNA聚合酶，比如Tth DNA聚合酶，在特定的條件下也具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，但是這些酶不如中溫逆轉(zhuǎn)錄酶高效。

在較低溫度下，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成的單鏈cDNA比雙鏈DNA（基因組DNA）更容易與引物非特異性的結(jié)合。非特異性的退火會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增的特異性較差，特別是在有限的cDNA的數(shù)量和低豐度的轉(zhuǎn)錄本的情況下，會(huì)降低反應(yīng)的靈敏性和可重復(fù)性。擴(kuò)增的特異性對(duì)于成功的RT-PCR是至關(guān)重要的，這可以通過(guò)同時(shí)使用包含特別修飾過(guò)的逆轉(zhuǎn)錄酶的新型的緩沖溶液和熱啟動(dòng)PCR實(shí)現(xiàn)。

多重PCR和RT-PCR

在多重real-time PCR中，可以在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)定量檢測(cè)幾個(gè)基因組靶標(biāo)DNA。多重real-time RT-PCR是一組類似的方法，用于在同一組反應(yīng)中同時(shí)定量檢測(cè)幾個(gè)不同的RNA靶標(biāo)。具體操作時(shí)，既可以采用兩步法RT-PCR，也可以采用一步法RT-PCR。

多重PCR和RT-PCR在很多應(yīng)用中有巨大的優(yōu)勢(shì)，比如基因表達(dá)分析，病毒載量檢測(cè)和基因分型檢測(cè)。目標(biāo)基因和內(nèi)質(zhì)控在同一個(gè)反應(yīng)中被同時(shí)擴(kuò)增，以避免單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)各個(gè)反應(yīng)小孔之間的差異。內(nèi)質(zhì)控可以是不同的樣本中，沒(méi)有表達(dá)差異的內(nèi)源性基因（比如看家基因），也可以是外部的核苷酸序列。對(duì)于病毒載量檢測(cè)而言，使用外源性的核酸作為內(nèi)質(zhì)控，可以檢測(cè)樣本的準(zhǔn)備是否成功，抑制劑存在與否以及PCR是否成功。多重分析可以非常高的精度對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，其中目標(biāo)基因的數(shù)量根據(jù)對(duì)照組的參比基因的數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在一個(gè)反應(yīng)中，對(duì)多個(gè)基因定量檢測(cè)減少了試劑的使用，節(jié)省了珍貴的樣本材料，并且提高了通量。

可以用光譜相距較遠(yuǎn)的熒光染料和適當(dāng)?shù)拇銣缁鶊F(tuán)標(biāo)記基因特異性探針，此類探針使得多重PCR和RT-PCR成為可能。這意味著染料的最大發(fā)射波長(zhǎng)必須被明確分離，并且彼此之間不能重疊。除此之外，反應(yīng)必須在支持多重分析的，適當(dāng)?shù)膔eal-time擴(kuò)增儀中進(jìn)行（即在同一個(gè)小孔或者試管中激發(fā)并檢測(cè)幾種不重疊的染料）。

全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA)

全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA)可采用非常少量的RNA，對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行擴(kuò)增，從而可以用real-time RT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行無(wú)限制的分析。RNA樣本的全轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增首先使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，并將cDNA連接，最終使用多重置換擴(kuò)增技術(shù)(MDA)進(jìn)行擴(kuò)增。

當(dāng)僅有ng級(jí)的RNA樣本時(shí)，所能進(jìn)行的real-time RT-PCR分析的數(shù)目是非常有限的。這一問(wèn)題可通過(guò)WTA解決。這種技術(shù)中，一個(gè)RNA樣本中所有的mRNA轉(zhuǎn)錄本都被復(fù)制了，以得到mg級(jí)別的cDNA模板。這些cDNA足夠進(jìn)行不受限制的real-time PCR分析，并得到穩(wěn)定的結(jié)果。

WTA技術(shù)

為了得到可靠的real-time PCR 結(jié)果，WTA方法需要能夠無(wú)偏且準(zhǔn)確的擴(kuò)增整個(gè)轉(zhuǎn)錄本。這意味著每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的序列和相對(duì)豐度在WTA實(shí)驗(yàn)中都保留下來(lái)，否則基因表達(dá)分析會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用了隨機(jī)的寡聚物和寡聚dT作為引物，構(gòu)建了覆蓋所有轉(zhuǎn)錄序列（包括3’端和5’端）的cDNA文庫(kù)。將這些cDNA連接起來(lái)，并且使用MDA技術(shù)，通過(guò)獨(dú)特的進(jìn)行性DNA聚合酶得到擴(kuò)增后的cDNA。這些cDNA保留了初始RNA樣本中的轉(zhuǎn)錄本呈遞信息。這對(duì)于精確的基因表達(dá)分析非常重要。

在進(jìn)行WTA實(shí)驗(yàn)時(shí)，同時(shí)考慮起始材料量（即細(xì)胞的數(shù)量或者RNA的數(shù)量）和感興趣轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)目是非常重要的。表“不同細(xì)胞數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本”顯示了起始材料量與轉(zhuǎn)錄本呈遞之間的關(guān)系（注意這僅作為指導(dǎo)：每一定量檢測(cè)的起始材料的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量可能會(huì)變化）。如果起始材料中，轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)目低于10（在表中用粗體顯示），可能會(huì)發(fā)生隨機(jī)性的問(wèn)題（即非常低數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本在高度稀釋的溶液中的不均勻分布）。這可能會(huì)在WTA的開(kāi)始階段，導(dǎo)致低拷貝轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量被低估。對(duì)于嵌合轉(zhuǎn)錄本應(yīng)該特別考慮。嵌合轉(zhuǎn)錄本是由僅在組織的一部分細(xì)胞中表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄而成的。由于這些轉(zhuǎn)錄本不是在每一個(gè)細(xì)胞中都存在，因此在較低的起始材料量的情況下（比如1–10²個(gè)細(xì)胞），它們不能被精確測(cè)定。

可靠的WTA取決于轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)目。10 ng的DNA相當(dāng)于500個(gè)細(xì)胞，在這種情況下，即使低拷貝數(shù)目的轉(zhuǎn)錄本也能被準(zhǔn)確的測(cè)定。使用更少的RNA或者非常有限數(shù)目的細(xì)胞，意味著起始材料中可能會(huì)缺失低拷貝轉(zhuǎn)錄本，或者僅包含部分低拷貝轉(zhuǎn)錄本。

不同細(xì)胞數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本

*含有各種轉(zhuǎn)錄本。
^?隨機(jī)的mosaic轉(zhuǎn)錄本。
^?隨機(jī)的低拷貝和mosaic轉(zhuǎn)錄本。 
^§隨機(jī)的低拷貝轉(zhuǎn)錄本，mosaic轉(zhuǎn)錄本有丟失。

參數(shù)	103個(gè)細(xì)胞*	103個(gè)細(xì)胞?	10個(gè)細(xì)胞?	1個(gè)細(xì)胞§
RNA量 (ng)	20	2	0.2	0.02
高拷貝轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量	107	106	105	104
中等拷貝轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量	105	104	103	102
低拷貝轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量	103	102	10	1
mosaics轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量	102	10	1	0

DNA污染

去除DNA污染

如果PCR的引物也能擴(kuò)增基因組DNA序列，RNA樣本中痕量基因組DNA的污染會(huì)干擾real-time RT-PCR的定量檢測(cè)。為了避免基因組DNA污染的負(fù)面影響，需要仔細(xì)的設(shè)計(jì)引物。如果這不能實(shí)現(xiàn)，應(yīng)該使用DNase I處理RNA樣本，以降解掉DNA污染物。

檢測(cè)RT-PCR中的DNA污染

使用合適的對(duì)照可以檢測(cè)到RT-PCR中的任何DNA污染物。應(yīng)分別在逆轉(zhuǎn)錄酶存在和不存在的情況下進(jìn)行反應(yīng)。如果在不存在逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下出現(xiàn)了產(chǎn)物，則說(shuō)明樣本中存在DNA污染物。

參考文獻(xiàn)

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