轉染的類型
瞬時轉染
當一個細胞被質粒瞬時轉染時，DNA進入細胞核中，但是并沒有整合到染色體上。這意味著細胞核中存在目標基因的很多個拷貝，從而導致蛋白的高水平表達。在基因轉染之后的24–96小時內能夠分析其轉錄。使用超螺旋的質粒DNA對于瞬時轉染是最有效的。siRNA、miRNA和mRNA也可用于瞬時轉染，并且它們轉染到細胞質中是效率最高的，并不需要轉染到細胞核中。
穩定轉染
在穩定或者永久性轉染中，轉染的DNA或者整合到染色體DNA中或者作為附加體保留在宿主細胞中。將質粒DNA穩定的整合到基因組中是很少發生的。可以將攜帶有抗生素抗性基因的其它質粒共轉染到細胞中，或者在攜帶目標基因的載體上同時包含有抗生素的抗性基因，以便能夠把穩定轉染的細胞挑選出來。如果siRNA和miRNA是篩選DNA載體轉錄成的短發卡結構，則能穩定轉染。但是，RNA分子本質上不能用于穩定轉染。
盡管相對于超螺旋的DNA分子而言，線性的DNA分子被細胞攝取的概率比較低，但是線性的DNA分子更容易整合到宿主的基因組中。成功整合了目標DNA或者保留了附加體質粒DNA的細胞能夠用一些選擇性的標志物區別出來。常用的選擇性標志物包括那些編碼氨基糖苷磷酸轉移酶（APH；neoR 基因）或者潮霉素B磷酸轉移酶（HPH）的基因。其它的選擇性標志物包括編碼腺苷脫氨酶（ADA）、二氫葉酸還原酶（DHFR）、胸苷激酶（TK）、或者黃嘌呤–鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（XGPRT；gpt基因）的基因。
快速正向轉染和反向轉染
在快速正向轉染中，平板培養和轉染在同一天進行。DNA或siRNA在不包含血清的培養基中稀釋。轉染試劑加入到稀釋過的核酸里面以便形成轉染試劑–核酸的復合物。細胞首先經過接種，然后復合物直接加入到剛被接種的細胞中。而在傳統的轉染中，細胞平板培養24小時之后才能進行轉染。在轉染前一天，細胞在包含血清的培養基中接種，并在正常的生長條件下孵育。第二天，在不包含血清的培養基中稀釋DNA或者siRNA。轉染試劑直接加入到稀釋后的DNA或者siRNA中，以形成轉染試劑–核酸復合物。在復合物的形成過程中，改變細胞的培養基，然后才能將轉染復合物加入到細胞中。
在標準的轉染或者快速正向轉染中，細胞首先加入到孔板的小孔中，然后加入轉染復合物。在反向轉染中，核酸加入到孔板的小孔中，然后加入轉染試劑。待二者形成復合物之后再向小孔中加入細胞，因此稱做反向轉染。
成功轉染的一般準則
成功的轉染受到很多因素的影響。細胞系的健康程度和存活力，使用的核酸的質量，轉染試劑，轉染時間的長度以及血清的存在與否都會影響轉染。
細胞
應在合適的培養基中培養細胞，提供血清和生長因子，保證細胞系的存活力。不要使用被污染（比如被酵母或者支原體污染）的細胞或者培養基。如果無法確定是否符合這一要求，應該使用冷凍的、未污染的原液重新對細胞接種。如果有哪些成分是不穩定的，一定要保證基質是新鮮的，因為缺失任何關鍵的成分都會損害細胞的生長。請保持孵育條件穩定在37°C，正確的CO2水平（通常為5–10%）和100%的相對濕度。
每一個細胞系都有最優的培養條件，具體請參照美國模式培養物集存庫(ATCC)網站。
血清
由于血清會干擾很多商業化的轉染試劑，部分轉染方案為獲得最優性能，要求提供無血清條件。您應核對自己的實驗方案，以確定是否需要滿足這方面要求。
匯合
原則上，細胞應該在匯合度為40–80%的情況下進行轉染。細胞太少會因為缺乏細胞和細胞的相互接觸導致生長情況較差。而細胞太多則會導致接觸抑制，使得細胞對外界核酸攝取發生抵抗。細胞具有活性且相互分離，才能獲得最好的結果。
傳代
注意保持較低的傳代數（<50）。除此之外，在一系列實驗中所使用的細胞的傳代數應該保持一致。操作過程務必保持謹慎，確保在轉染之前，用于轉染的細胞互相分離并且具有至少90%的存活力。與無限增殖細胞系類似，細胞的特征可能隨著時間而改變，在傳過數代之后，細胞可能對于相同的轉染條件并無反應，造成較差的表達結果。
核酸的量
核酸的量的最佳值存在很大差異，具體取決于核酸的類型、細胞的數目、培養皿/平板的尺寸和選用的細胞系。
顯著增大轉染核酸量并不能得到更好的結果。事實上，如果初始的轉染結果令人滿意的，應減少核酸量并測試其效果（選取最佳試劑/核酸比常數）。
在部分情況下，某個范圍內的核酸濃度對于轉染是最合適的；而在此范圍之外，轉染效率會降低，甚至大幅降低。
核酸太少可能導致實驗效果不出現。核酸太多則會對細胞產生毒害。
轉染試劑的量
這取決于所使用的轉染試劑，應該仔細的優化這一參數。
轉染復合物的形成和復合物的孵育時間
很多化學轉染試劑都有最佳的時間框，在這個時間范圍內，能形成具有最佳半徑的轉染復合物。這個時間范圍通常在5到30分鐘，具體取決于轉染試劑的性質。請參考試劑廠商推薦的時間。
通常情況下，在加入新的培養基或者替換培養基之前，轉染試劑應該和細胞接觸一段時間（以便最大程度的減小試劑的毒害作用）。最佳的轉染時間取決于細胞系，轉染試劑和所使用的核酸。
部分情況下，相對于將轉染復合物加入到培育好的細胞上這種傳統方法， 在含有轉染復合物的孔或平板上培養細胞會增大轉染效率。這種反向轉染方案的另一個優點是可以在同一天完成細胞的接種和轉染，將實驗流程縮短一整天。
DNA轉染準則
質粒DNA轉染注意事項
DNA的質量能強烈影響轉染的效果。使用最高純度的質粒DNA，才能獲得最佳的轉染效果。
內毒素，也被稱做脂多糖(LPS)，是格蘭氏陰性菌（比如大腸桿菌）細胞膜的成分。它通常在質粒制備的裂解步驟中釋放出來，并且與質粒DNA共純化。與質粒DNA共存的內毒素會導致轉染效率顯著下降，特別是對于原代細胞和敏感性的細胞系而言。如果要轉染內毒素敏感的細胞（比如原代細胞、懸浮細胞和造血細胞），或者想要獲得最高的轉染效率和最低的細胞毒性，我們推薦使用一些商業化的試劑盒來純化DNA——這些試劑盒是經過專門的設計，能去除內毒素，保證得到最佳的轉染結果。
DNA分子的構象也會影響轉染的效率。使用超螺旋的質粒DNA能夠達到最高的瞬時轉染的效率。在穩定轉染中，相對于質粒DNA而言，線性DNA更容易整合到宿主基因組中，盡管線性DNA進入細胞比質粒DNA要難。
如果轉染到細胞中的DNA編碼產物對于細胞有毒害作用，則其表達會導致細胞死亡。在這種情況下，可以使用較弱的啟動子或者可誘導的啟動子限制毒性基因產物表達對細胞造成的損害。
轉染技術選擇
關于核酸的轉染，目前發展了幾種不同的方法，這些方法分別使用了DEAE–右旋糖苷、磷酸鈣、電穿孔、脂質體、非脂質體的脂質和活化的樹枝狀分子。轉染技術的選擇能強烈的影響轉染效率。理想情況下，轉染應該迅速并且易于操作，有較高的轉染效率和可重復性的結果，并且具有最低的細胞毒性。
優化的重要性
為了得到最佳結果和最高效率的轉染，應該根據每一種細胞系–質粒的組合選擇最佳的DNA/轉染試劑比。因此，對于每一種新使用的細胞系–質粒組合而言，進行實驗優化非常關鍵。
RNA轉染準則
隨著RNA干擾（一種使用siRNA、siRNA、誘導基因沉默的技術）的發現，RNA轉染變得日益重要。
RNA轉染注意事項
很多RNA（包括mRNA、體外轉錄的RNA、病毒RNA、RNA寡聚物、siRNA和核酶）都能夠用于轉染。對于mRNA，一些特征的存在與否（比如5’端帽子、內部核糖體進入位點或者poly–A尾），能顯著的影響轉染效率。
使用最高純度、無DNA和蛋白污染的RNA轉染時，能得到最佳的轉染結果。同時還應考慮到，如果所表達的基因對細胞有毒性的話，過量表達可能導致細胞死亡。
有許多廠商能夠提供高純度即用型siRNA，供您進行RNA干擾實驗。為獲得最佳的基因沉默效果，必須使用正確的序列。應該注意到，關閉必需基因的表達可能會導致細胞死亡。
避免RNA污染
目前仍無任何純化方法能保證RNA完全不受DNA污染，即使在瓊脂糖凝膠上看不到DNA條帶，也并不能保證這一點。在進行RNA轉染時，可以使用不含RNase的的DNase純化RNA，或者使用其它能取得類似效果的純化方法。
核糖核酸酶(RNase)非常穩定，并且通常不需要輔因子就能發揮功能。由于RNase很難失活并且數分鐘內就能夠破壞RNA，塑料耗材、玻璃器皿或者溶液在使用之前必須排除任何RNase污染的可能性。在轉染過程中，必須非常仔細，以避免不經意間引入任何RNase污染。為了在處理RNA時創造并且維持一個沒有RNase的環境，應該采取一些微生物學上的無菌技術，并且推薦使用一些無菌的一次性的塑料試管。
優化的重要性
為了得到最佳RNA轉染結果，須優化以下因素：
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轉染時的細胞密度
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RNA與轉染試劑的比例
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與轉染復合物共同孵育的時間
我們建議，對于每一種細胞類型和RNA的組合，都要仔細的優化這些參數。一旦得到了最優值，這些參數在未來的實驗中應該保持不變。
siRNA轉染準則
RNA干擾（RNAi）在哺乳動物細胞中的應用，給功能基因組學領域帶來了革命性的變化。其所具有的簡單、有效的下調哺乳動物細胞中特定基因表達的能力，在科學、商業和醫療領域有著潛在的巨大應用。siRNA高效轉染是有效沉默基因的關鍵。
RNA干擾實驗中的脫靶效應
研究表明，siRNA轉染會導致脫靶效應，即siRNA影響了非同源性基因或者半同源性基因的表達。脫靶效應包括mRNA降解、翻譯抑制或者誘導干擾素應答(5–8)。脫靶效應的機制目前還不完全清楚。可能是由于siRNA和與目標mRNA具有高度同源性的mRNA相互作用，或者是由于siRNA發揮了和miRNA相似的功能，還可能是由于細胞對于siRNA毒性的應激反應。除此之外，一些研究者還觀察到了siRNA誘導的干擾素應答。
脫靶效應能導致RNA干擾實驗中的錯誤結果。研究認為，使用低濃度的siRNA能夠很大程度上避免脫靶效應。
siRNA轉染的優化
計算siRNA濃度
一個雙鏈，20 nt長度的siRNA分子的一些近似數值：
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20 μM濃度的siRNA大約相當于0.25 μg/μl
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21核苷酸長度的siRNA的分子量大約為13–15 μg/nmol
為確保最佳的貼壁細胞siRNA轉染效果，建議優化以下參數。
siRNA的量
siRNA的量對于有效轉染和基因沉默是非常關鍵的。對于所使用的每一種細胞類型和siRNA的組合，都應該優化轉染試劑和siRNA的比例。
轉染時的細胞密度
對于每一種要轉染的細胞類型，應該確定其轉染時的最佳的細胞匯合度，并且在以后的實驗中保持恒定。這可以通過在接種前對細胞進行計數來實現。在使用傳統方案的情況下，可以通過在接種常數和轉染常數之間保持時間間隔來實現。這樣可以確保細胞的密度不是太高，并保證細胞在轉染時維持最佳的生理狀況。
不同形式的細胞的接種數量的準則顯示在下列表格中：貼壁細胞接種的典型數目、懸浮細胞和巨噬細胞接種的典型數目以及原代細胞接種的典型數目。
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384孔板
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4000–10,000
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2000–5000
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96孔板
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1–5 x 104
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0.5–3 x 104
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48孔板
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2–8 x 104
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1–4 x 104
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24孔板
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0.4–1.6 x 105
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2–8 x 104
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12孔板
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0.8–3 x 105
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0.4–1.6 x 105
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6孔板
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1.5–6 x 105
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0.8–3 x 105
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60 mm培養皿
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0.3–1.2 x 106
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1.5–6 x 105
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100 mm培養皿
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2–4 x 106
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1–2 x 106
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96孔板
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3–6 x 104 懸浮細胞
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24孔板
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1–2 x 105 懸浮細胞
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96孔板
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1–6 x 104 巨噬細胞
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24孔板
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0.4–2 x 105 巨噬細胞
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96孔板
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3–6 x 103 分化巨噬細胞
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24孔板
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1–2 x 104 分化巨噬細胞
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96孔板
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20,000
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48孔板
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40,000
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24孔板
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60,000
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12孔板
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120,000
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6孔板
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200,000
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多孔板轉染——制備預混液
如果你在多孔板上進行轉染，則需要制備轉染復合物預混液或者轉染試劑和培養基質（取決于實驗方案）的預混液以便注入孔板的小孔中。
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在制備預混液之前，計算所需的每一種成分的體積以及總體積。
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準備比需要的量多10%的預混液以避免移液錯誤（也就是說，對于一個48孔板，準備足夠53個小孔使用的預混液）。
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用一個可重復使用的移液器來分配預混液。
進行合適的RNA干擾對照實驗
進行合適的對照實驗是非常重要的，只有這樣，才能夠正確地解釋實驗結果。我們推薦下列對照實驗。
陽性對照siRNA
這種siRNA是指已經明確知道能高效率敲除目標基因的siRNA。陽性對照用來確定轉染實驗和敲除分析的實驗設置能在最佳的狀態下工作。如果一個siRNA所敲除的基因能影響正在研究的表型，那么這個siRNA也應該用做陽性對照，以確保對表型的評估能在最佳狀態下工作。在每一個RNA干擾實驗中，都應該轉染陽性對照siRNA。
陰性對照siRNA
陰性對照siRNA應該是不具有基因沉默效果的siRNA，并與所有已知的哺乳動物基因都沒有同源性。轉染陰性對照siRNA是為了確定表型和基因表達的改變是否是非特異性的。在每一個RNA干擾實驗中，都應該轉染一個陰性對照siRNA。
轉染對照siRNA
這種對照組是為了測定轉染的效率。轉染的效率可以通過幾種不同的方式來測定，比如在轉染熒光標記的siRNA之后使用熒光顯微鏡檢測，或者在轉染影響細胞存活的必需基因的siRNA之后，觀測細胞的死亡水平。這種對照應該用于實驗參數的優化，比如，當對一個新的細胞系進行RNA干擾實驗時。
Mock轉染對照
Mock轉染對照中的細胞經歷完整的轉染過程，但是并不加入siRNA（也就是說，細胞僅用轉染試劑處理）。這種對照實驗是為了排除任何由轉染試劑或者轉染過程所引起的非特異性現象。
未轉染細胞對照
應該對未經處理的細胞進行基因表達的分析，以便測定正常水平的基因表達。未經處理的細胞的分析結果可以與所有其它樣本的結果相比較。在每一個RNA干擾實驗中都應該對未經處理的細胞進行分析。
用于表型確認的額外的siRNA
敲除基因對表型的影響必須用至少一個額外的siRNA進行確認。這個額外的siRNA應該以mRNA的不同區域作為靶標。
miRNA轉染操作指南
microRNA（miRNA）是一系列與siRNAs具有相似特征的內源性小RNA分子。近些年來，已經發現miRNA在許多不同的生物過程中發揮著作用，比如發育、分化和凋亡。miRNA表達的異常調節已被報道與數種癌癥和其他疾病有關。
miRNA系統是基因表達的一種內源性調控機制。成熟的miRNA主要是通過轉錄后抑制起到內源性基因調控的作用。此外，miRNAs可以通過脫腺苷化和/或者脫帽介導mRNA的破壞。自然生成的miRNA–結合位點通常位于目標mRNAs的3'端非編碼區（UTR）。它們的部分互補性使得真正結合位點的陽性鑒定變得困難和不精確。
轉染miRNA模擬物或抑制劑是一種用于鑒別特定miRNA的靶標和作用的技術。miRNA模擬物是化學合成的miRNA，其模擬的是細胞轉染后自然生成的miRNA。miRNA抑制劑是單鏈、經過修飾的RNA，其在轉染后特異性的抑制miRNA功能。轉染一個miRNA模擬物后導致的基因表達減少或者轉染一個miRNA抑制劑后導致的表達增加都證明了所研究的miRNA參與了基因調控。另外，miRNA在各種路徑中所起的作用可以在轉染miRNA模擬物或者抑制劑后通過檢查一個特定的表型來研究。
miRNA模擬物或者抑制劑轉染
當使用24孔板時，我們建議首先在孔板中植入細胞，然后再加入模擬物/抑制劑–試劑復合物，目的是確保細胞與復合物混合最優。但是，反向轉染是首先向孔板中加入復合物，然后再在復合物之上加入細胞，根據具體需要而操作。如需進行反向轉染，簡單的調換向孔板加入細胞與復合物的順序。
但是，對于96孔板，我們建議使用反向轉染，因為反向轉染快速而且方便，并且通常被用于高通量模式。反向轉染也是miRNA模擬物和miRNA抑制劑在24孔板上進行共轉染的最優方法。
質粒DNA和miRNA模擬物/抑制劑共轉染
很多miRNA實驗涉及到miRNA模擬物和/或抑制劑與質粒DNA載體一起進行的共轉染，在載體中miRNA–結合位點融合了一個報告基因，比如熒光素酶。
優化miRNA轉染
有效下調目標基因或者抑制miRNA功能所需miRNA/抑制劑的量差異很大，具體取決于miRNA、細胞株系和所選的分析方法。為了測定提供最優結果所需的濃度，需要使用不同濃度的模擬物/抑制劑進行優化實驗。
miRNA模擬物最終濃度低到0.5 nM即可抑制目標蛋白的表達。但是，也可能需要一個更高的濃度，尤其是在蛋白質水平上進行下游分析時。經證實，miRNA抑制劑在50 nM濃度即可抑制miRNA的功能。更低的抑制劑濃度也可能有效。
除了優化濃度，測定轉染后分析結果的最優化時間的時程實驗也是必須的。miRNA模擬物或抑制劑的效果通常并不會導致轉錄或者蛋白質水平立刻改變。
進行正確的miRNA對照實驗
為正確解釋miRNA模擬物或抑制劑實驗結果，使用正確的對照非常重要。每個實驗都應該包括適當的陽性和陰性對照。為了使結果解釋或者問題解決成為可能，額外的對照也是必須的。
miRNA模擬物實驗–陽性對照
陽性對照模擬物轉染可用于確定實驗系統正按照預期進行（比如，模擬物有效轉染并且下調目標基因）。這個對照也可以用在濃度優化實驗中，其通過不同濃度轉染以測定提供最優結果的濃度。陽性對照通常應該在每個使用miRNA模擬物的實驗中進行轉染，以便確定實驗條件始終是最優的。
miRNA模擬物實驗–陰性對照
陰性對照應該在每個實驗中轉染，可以顯示實驗結果是否是非特異性的。陰性對照與所研究miRNA模擬物的實驗結果的對比可以用于確定觀察結果特異于所研究的miRNA。陰性對照的實驗結果也應該與未被轉染的細胞結果進行對比。在陰性對照實驗中，未轉染細胞與轉染細胞的基因表達與表型應該相似。由于miRNA模擬物與siRNA化學上相似，通常只是在序列上有所不同，所以一個陰性對照siRNA也可以用作一個陰性對照miRNA模擬物。
miRNA模擬物實驗–陽性對照
在涉及miRNA抑制劑轉染的實驗中，由于在細胞中存在與目標基因相互作用的其他miRNA，抑制劑效果測定通常會非常復雜。與模擬物單獨轉染相比，模擬物和抑制劑的共轉染可能導致表達增加。這確定了抑制劑有效地抑制了模擬物，導致了目標基因的上調。
在報告載體用于下游分析的實驗中，載體、模擬物和抑制劑都應該一起共轉染，而在其平行實驗中，載體和模擬物應該共轉染與模擬物單獨轉染相比，模擬物和抑制劑的轉染可能導致表達增加。這確定了抑制劑有效地抑制了模擬物，導致了報告基因上調。
miRNA抑制劑實驗–陰性對照
在每個抑制劑實驗中轉染陰性對照，可以顯示實驗結果是否是非特異性的。該對照轉染后得到的結果應該與未轉染的細胞結果相似。陰性對照與所研究抑制劑的實驗結果的對比可以用于確定觀察結果特異于所研究的抑制劑。
在報告載體用于下游分析的實驗中，陰性對照應該是抑制劑陰性對照與報告載體的共轉染。
轉染對照
為獲得最優實驗結果，轉染效率應該盡可能的高。開始進行實驗或者使用一種新的細胞株系時，需要在不同條件下操作多重轉染以便確定獲得最高轉染效率的最優條件。在以后的實驗中可以保存與陰性對照轉染相比導致最大程度細胞死亡的轉染條件。該對照的操作應該出現在優化實驗和初始實驗中，并且可以用作每個實驗中的常規轉染對照。
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