基于亞硫酸氫鹽轉化的DNA甲基化分析

將DNA暴露在亞硫酸氫鹽中能導致未甲基化的胞嘧啶迅速的脫氨基轉換成6-磺?；遴奏?。在高pH值情況下，6-磺?；遴奏摶酋；D變成脲嘧啶并最終通過序列擴增轉換成胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不會發生這種轉變。將這種轉化過的DNA與初始的未轉化的序列進行比對，能確定CpG島上甲基化位點的位置和豐度的細節。高分辨率溶解分析（HRM）是一種快速的篩選工具，能精確的檢測亞硫酸氫鹽轉化的DNA上的CpG島甲基化狀態的變化。Pyrosequencing能定量的描述單個CpG位點的甲基化的百分比?？捎糜诖蟪叨燃谆治龅钠渌晒┨娲姆椒ㄟ€包括甲基化特異性PCR（MSP），這種方法具有較高的特異性和靈敏度。這些分析方法都有商業化的試劑盒。

基于限制性酶消化的DNA甲基化分析

這種方法可以不使用亞硫酸氫鹽修飾而研究單獨基因上或者疾病或通路相關的基因panel上的CpG島的甲基化狀態。這種方法依賴于兩種不同的限制性內切酶對于目標序列不同的剪切方式。這兩種酶在發揮其生物活性時，對各自識別序列中是否有甲基化胞嘧啶的要求不同。每一種酶消化之后殘留的DNA的相對量可以通過real-time PCR進行定量分析，從而得到單獨基因甲基化狀態以及gene panel的甲基化情形的可靠計算數據。

表觀遺傳學相關的DNA-蛋白相互作用的體內分析

染色質免疫共沉淀(ChIP)方法是分析活細胞中染色質DNA與轉錄因子、共調節因子、修飾組蛋白、染色質重塑蛋白以及其它核因子相互作用的強大的多功能方法。這種方法可用于對DNA–核蛋白的動態相互作用進行活體分析。這種相互作用在表觀遺傳學中的基因表達調控中起到了非常重要的作用。

一種新型的表觀遺傳學標志物：5-羥甲基胞嘧啶(5 hmC)

5-羥甲基胞嘧啶是哺乳動物基因組DNA中一種重要的表觀遺傳學標志物。5-羥甲基胞嘧啶是最近才發現的一種堿基修飾。它是經TET加氧酶家族（1，2）催化5-甲基胞嘧啶形成的。

它被稱為“第六種DNA堿基”，關于這種堿基的所扮演的角色有很多推測，但是它的準確的生物學功能還沒有闡明。初步的結果認為5-羥甲基胞嘧啶可能具有與5-甲基胞嘧啶不同的重要功能。目前的證據顯示5-羥甲基胞嘧啶可能代表了一種DNA去甲基化的新途徑，這種途徑涉及到將羥甲基化胞嘧啶轉換成胞嘧啶的修復機制。這可能在表觀遺傳學領域有非常重要的含義，能加速表觀遺傳學的研究。

甲基化特異性PCR（MSP）的引物設計

甲基化特異性PCR（MSP）是一種要求很高的應用。為了得到可靠的結果，它要求能高度特異性的區分胞嘧啶和亞硫酸氫鹽轉化試驗中由甲基化和未甲基化的胞嘧啶轉化得到的胸腺嘧啶。

甲基化特異性PCR的引物設計通常比較困難，因為這種引物的設計要求覆蓋幾個CpG位點。這樣就不能檢測CpG島里面單獨的CpG甲基化。

引物在其序列里面需要包含至少一個CpG位點，并且最好位于它們的序列中遠離3’端的位置，以便能最大程度的區分甲基化和未甲基化的DNA。

引物在其序列中應該包含足夠的不位于CpG島上的胞嘧啶，以便僅擴增那些被亞硫酸氫鹽修飾過的DNA。包含有更多的不位于CpG島上的胞嘧啶的引物更加適用。

甲基化DNA（M pair）和未甲基化DNA（U pair）的引物應該在其序列中包含相同的CpG位點。比如，M pair的正向引物包含這樣的序列：ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA，那么U pair的正向引物必須也包含這兩個CpG位點，比如，ATTAGTTTTGTTTAAGGTTTGA；盡管它們可能在長度和起始位點上有差別。M pair和U pair最好具有相似的退火溫度。

對照DNA

在進行甲基化分析的時候，應該進行對照試驗，比如，在進行甲基化特異性PCR（MSP）時，應該保證PCR的引物能特異性的檢測亞硫酸氫鹽轉化的甲基化和未甲基化的DNA。

為了進行對照實驗，需要亞硫酸氫鹽轉化的甲基化的DNA、亞硫酸氫鹽轉化的未甲基化的DNA和基因組DNA。應該使用每一種類型的DNA來判斷PCR的特異性。比如，甲基化DNA特異性的引物對于甲基化的對照DNA僅顯示一個信號（參見下表）。

除此之外，基因組DNA還可用于測定亞硫酸氫鹽反應中亞硫酸氫鹽轉化的效率。

預期PCR結果與對照

DNA類型	未甲基化的靶基因的引物(PCR 1)	未甲基化的靶基因的引物(PCR 2)	甲基化的靶基因的引物 (亞硫酸氫鹽轉化) (PCR 3)
未甲基化的對照DNA	PCR產物	無PCR產物	無PCR產物
未甲基化的對照DNA（亞硫酸氫鹽轉化）	無PCR產物	PCR產物	無PCR產物
甲基化的對照DNA（亞硫酸氫鹽轉化）	無PCR產物	無PCR產物	PCR產物
無模板對照	無PCR產物	無PCR產物	無PCR產物

參考文獻

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