何為RNA?
RNA是具有多種不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA轉(zhuǎn)錄得到的，用做蛋白質(zhì)合成的模板。蛋白質(zhì)的合成是由核糖體完成的，核糖體由核糖體RNA（rRNA）和蛋白質(zhì)組成。用于蛋白合成的氨基酸，是通過轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）輸送到核糖體上的。RNA分子也是參與RNA轉(zhuǎn)運過程的核糖蛋白的一部分。非編碼RNA也是非常重要的。它們是不翻譯成蛋白質(zhì)的功能RNA分子。這樣的RNA分子包括tRNA、rRNA、核仁小RNA（snoRNA）、微小RNA（miRNA）、小干擾RNA和piwi-interacting RNA（piRNA）。它們通常在基因表達的調(diào)控中發(fā)揮作用。
miRNA是一類內(nèi)源性的（自然產(chǎn)生的），約18–24個核苷酸大小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控中發(fā)揮作用。一個miRNA可能在每個細胞中有超過105個拷貝，但是從每個細胞中總RNA質(zhì)量的角度來看，這些RNA又是微不足道的。由于它們非常短，因此通常需要特別的分離和分析方案。
一個典型的快速生長的哺乳動物細胞培養(yǎng)中,每個細胞大約含有10–30 pg的RNA，而一個完全分化的原代細胞中，RNA的量要少得多——大約每個細胞中RNA的含量小于1 pg。細胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大約占細胞中RNA總量的1–5%，但是具體的量取決于細胞類型和細胞的生理狀態(tài)。一個動物細胞中，大約有360,000個mRNA分子，組成了大約12,000個轉(zhuǎn)錄本，一個典型轉(zhuǎn)錄本的長度大約為2 kb。一些mRNA分子占到了總mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。這些“稀有的”或者“低豐度”的mRNA分子在每個細胞中只有5–15個拷貝。但是，這些稀有的mRNA大約有11,000種，占到了mRNA數(shù)量的45%。
一個生物體中的基因是相對固定的，因此，mRNA的組成代表了在給定的條件下，基因的表達方式。使用雜交技術，包括RNA印跡法（northern印跡）和微陣列分析，或RT-PCR技術、轉(zhuǎn)錄本測序技術（RNA-seq）對RNA進行分析，能夠充分反映一個生物體中的基因表達譜。但是，與DNA相比，RNA相對不穩(wěn)定。這很大程度上是由于存在會降解RNA分子的核糖核酸酶(RNases)。
核糖核酸酶非常的穩(wěn)定，不需要輔因子，在非常低濃度的時候就有很高的催化效率，并且不容易失活。核糖核酸酶的污染可以來自于人類的皮膚和攜帶有細菌和霉菌的塵埃顆粒。因此，RNA的分離和分析需要特別的技術。
這部分描述了成功的RNA穩(wěn)定，純化和分析的流程。
|
每個細胞中的總RNA
|
<1–30 pg
|
|
細胞核中總RNA的比例
|
~14%
|
|
細胞核中DNA:RNA
|
~2:1
|
|
mRNA分子
|
2 x 105 – 1 x 106
|
|
mRNA常規(guī)大小
|
1900 nt
|
|
rRNA (28S, 18S, 5S)
|
80–85%
|
|
tRNAs, snRNAs, low MW species
|
15–20%
|
|
mRNAs
|
1–5%
|
|
低
|
5–15
|
11,000
|
<0.004%
|
|
中等
|
200–400
|
500
|
<0.1%
|
|
高
|
12,000
|
<10
|
3%
|
|
細胞培養(yǎng)液 (1 x 106個細胞)
|
NIH/3T3
HeLa
COS-7
LMH
Huh
|
10
15
35
12
15
|
|
小鼠/大鼠組織 (10 mg)
|
胚胎(13-day)
腎
肝
脾
胸腺
肺
|
25
20–30
40–60
30–40
40–50
10–20
|
|
酵母 (1 x 107個細胞)
|
S. cerevisiae
|
25
|
|
植物 (100 mg葉片)
|
擬南芥
玉米
西紅柿
番茄
|
35
25
65
60
|
microRNA
小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的（自然產(chǎn)生的），約22個核苷酸的非編碼RNA分子，它們參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。它們與siRNA分子具有類似的特征。
miRNA分子在很多生物學過程中發(fā)揮了重要作用，包括細胞的分化和發(fā)育，細胞信號轉(zhuǎn)導和對感染的應答等。大量的證據(jù)顯示，miRNA表達的紊亂是一些疾病發(fā)生的原因和標志，包括多種癌癥。在血清和血漿中可檢測到無細胞的miRNA分子，而疾病會導致它們表達水平變化。這些發(fā)現(xiàn)，使得無細胞miRNA的表達很可能作為疾病診斷和預防中的生物標志物。
miRNA和siRNA的途徑都與雙鏈RNA相關，但是這些RNA分子的來源不同。與誘導RNA干擾的雙鏈RNA不同，miRNA是由基因組編碼的。除此之外，miRNA的前體（pre-miRNA）不完全是雙鏈的，而是包含有雙鏈區(qū)域的發(fā)卡結(jié)構。與RNAi不同（參考RNAi），miRNA的作用主要是調(diào)節(jié)細胞自己的基因。人類具有超過2000種miRNA分子，據(jù)估計，它們調(diào)節(jié)超過三分之二的人類基因。
miRNA系統(tǒng)是調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性機制。成熟的miRNA分子，主要通過翻譯抑制來調(diào)控內(nèi)源性基因的表達。除此之外，miRNA能通過快速的脫腺苷化作用和去除帽子來摧毀mRNA。自然生成的miRNA分子的結(jié)合位點，通常在目標mRNA 3’端的非翻譯區(qū)。在動物的miRNA分子中，序列的部分匹配給確定真正的結(jié)合位點帶來困難，并且降低了結(jié)合位點確定的準確性。
miRNA模擬物和抑制劑
miRNA 模擬物是化學合成的，雙鏈RNA分子（通常長度為18–24個核苷酸），通過轉(zhuǎn)染到細胞中，模擬成熟的內(nèi)源性miRNA分子。miRNA抑制劑是單鏈（通常長度為21–25個核苷酸），經(jīng)過修飾的RNA分子，通過轉(zhuǎn)染到細胞中，特異性的抑制miRNA的功能。模擬物和抑制劑包含一些化學修飾，以便提高活性或者增強其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。
通過將miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到細胞中，并進行下游的基因表達分析或者表型分析，可以闡明特定miRNA分子的目標和發(fā)揮的作用。這些實驗可以研究單個miRNA錯誤調(diào)節(jié)所造成的生物學影響，也能用于確定某個miRNA分子的特異性靶標基因。miRNA轉(zhuǎn)染之后，如果降低或者提高基因的表達水平，說明研究的miRNA參與調(diào)節(jié)了這個基因的表達。類似的，miRNA在很多通路中的作用，都可以通過檢測miRNA模擬物或者抑制劑轉(zhuǎn)染之后的特定表型來研究。
miRNA模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染對于下游應用的影響，通常可以通過如下方案來分析：
-
攜帶有報告基因，比如熒光素酶，和一個或者多個位于3’端非翻譯區(qū)的miRNA結(jié)合位點的質(zhì)粒載體做為miRNA的靶標。miRNA的模擬物/抑制劑與載體共轉(zhuǎn)染到細胞中。在轉(zhuǎn)染之后，進行報告基因檢測實驗，比如熒光素酶檢測實驗。通過將上述轉(zhuǎn)染的結(jié)果與只轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的結(jié)果比較，確定miRNA模擬物和抑制劑的影響。
-
將miRNA的模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染到細胞中，然后檢測相關的內(nèi)源性基因（即所研究的miRNA分子的靶標）的表達。通過將結(jié)果與未轉(zhuǎn)染的細胞或者轉(zhuǎn)染了陰性對照的細胞的表達結(jié)果相比，可以確定miRNA模擬物/抑制劑的作用。由于miRNA通常抑制目標基因的翻譯，而不降解目標基因的轉(zhuǎn)錄本，因此，一般通過檢測蛋白的表達水平來確定基因的表達水平，比如通過蛋白質(zhì)印跡法。這意味著miRNA模擬物/抑制劑的影響通常不能通過定量的real-time PCR 來檢測。
siRNA和RNAi
siRNA
小干擾RNA（通常稱做siRNA）參與多種生物學過程——最常見的是RNA干擾或者RNAi。
大多數(shù)RNA是單鏈的，但是，siRNA由兩條互補的核酸鏈組成，與DNA類似。siRNA的長度大約為20–25個核苷酸。siRNA在RNAi過程中扮演了重要角色，它們通過互補的核苷酸序列來干擾特定基因的表達。
長度為21個核苷酸的雙鏈siRNA分子的一些近似值：
-
20 μM的siRNA相當于濃度大約為0.25 μg/μl
-
長度為21個核苷酸的siRNA的分子量大約為13–15 μg/nmol
RNAi
RNA干擾（或者RNAi）是細胞中的一種自然發(fā)生的過程，它能夠關閉或者沉默特定基因的活性。RNA干擾于1998年被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)是研究基因功能的強大工具。
RNAi通過干擾信使RNA（mRNA）所攜帶的信息發(fā)揮作用，從而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性，基因也就失活了。
誘導RNAi的雙鏈RNA分子（siRNA），在進入細胞之后，被Dicer酶切割成小的片段。這些小的片段，作為引導物，引導siRNA與具有互補序列的mRNA相結(jié)合。然后，這些細胞內(nèi)的mRNA被切割，從而有效地破壞了它們所攜帶的信息，并且沉默相應基因的表達。
RNAi的過程相當復雜。雙鏈RNA被RNase III識別，然后切割成21–23個核苷酸大小的siRNA分子。這些siRNA分子參與組成了稱做RISC（RNA-induced silencing complex，RNA 誘導的沉默復合物）的RNAi靶標復合物，這些復合物能夠破壞與siRNA同源的mRNA分子。靶標mRNA分子在其與siRNA分子序列互補區(qū)域的中心處被切割，然后導致靶標mRNA分子被降解，降低了蛋白的表達。
使用siRNA
siRNA分子是RNAi過程中的主要效應因子，可以通過化學方法或者酶催化的方法在體外合成。siRNA的序列設計對于有效的基因沉默是非常關鍵的，它們的設計方法是基于對RNAi過程的理解，以及對天然存在的siRNA分子的功能的理解，開發(fā)出來的。
siRNA的輸送對于基因沉默實驗是至關重要的。合成的siRNA分子可以通過電穿孔或者親脂的試劑，輸送到細胞內(nèi)。但是，這兩種方法都是暫時的。質(zhì)粒系統(tǒng)能夠用于表達短發(fā)卡RNA（shRNA）分子，它們是Dicer酶的底物，在體內(nèi)能成熟成為siRNA分子。這樣的系統(tǒng)能穩(wěn)定地抑制目標基因的表達。也有一些病毒輸送系統(tǒng)，能夠?qū)hRNA輸送到難于轉(zhuǎn)染的細胞系中。
RNA操作常見注意事項
核糖核酸酶（RNase）是非常穩(wěn)定、活躍的酶，它們通常不需要輔因子就能發(fā)揮功能。由于核糖核酸酶難以失活，并且很小的量就足以破壞RNA分子，因此在沒有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情況下，不要使用任何塑料或者玻璃器皿。處理RNA時應非常小心，以避免在純化的過程中或者純化之后，將核糖核酸酶無意的引入到RNA樣品中。為了創(chuàng)造并維持沒有核糖核酸酶的環(huán)境，在預處理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液處理RNA時，一定要采取以下預防措施。
常規(guī)操作
處理RNA時，一定要使用合適的微生物學的無菌技術。手和灰塵顆粒可能會攜帶細菌和霉菌，是最常見的核糖核酸酶污染源。為了阻止來源于皮膚表面或者實驗室器械灰塵上的核糖核酸酶污染，在操縱試劑以及RNA樣品的時候，一直要佩戴乳膠手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情況下，要經(jīng)常更換手套，并將試管處于關閉狀態(tài)。當用移液管吸取溶液用于下游應用時，要將純化過的RNA放在冰上。
為了去除工作臺表面、非一次性塑料器皿和實驗室器械（比如，移液管和電泳槽）上的核糖核酸酶污染，推薦使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常見的實驗室試劑去除核糖核酸酶的污染。為了去除塑料器皿上的污染，使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗滌，然后使用去RNase的水洗滌；如果塑料器皿具有耐氯仿性，則可用氯仿洗滌。為了去除電泳槽的污染，可使用去污劑清潔（比如，0.5%的SDS），使用去RNase的水洗滌，然后用乙醇洗滌（如果電泳槽具有耐乙醇性），之后晾干。
重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套，以及具有護目鏡。請參考產(chǎn)品廠商提供的相應安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。
一次性塑料耗材
在處理RNA的時候，推薦使用無菌的，一次性的聚丙烯管。這些試管通常沒有核糖核酸酶，因此不需要預處理使核糖核酸酶失活。
非一次性的塑料耗材
非一次性的塑料耗材在使用之前應該進行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材應該嚴格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗滌，然后用去RNase的水洗滌。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗滌，以使核糖核酸酶失活。
玻璃器皿
玻璃器皿在使用之前，應該進行處理，以確保其不含有核糖核酸酶。用于處理RNA的玻璃器皿在使用之前，應該使用去污劑清潔，嚴格的洗滌，并在240°C的烘箱中烘烤至少4小時（如果更方便的話，可以過夜）。也可以使用DEPC（焦碳酸二乙酯）處理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC（0.1%的水溶液）充滿玻璃器皿，在37°C的條件下過夜（12小時），然后使用高壓釜處理或者加熱到100°C 15分鐘，以去除剩余的DEPC。
重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產(chǎn)品廠商提供的安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。
電泳槽
電泳槽應使用去污劑（比如，0.5%的SDS）清潔，嚴格的用去RNase的水洗滌，然后使用乙醇洗滌，之后晾干。
重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產(chǎn)品廠商處提供的相應安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。
重要：一些電泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性，需要仔細查閱廠商說明書。
溶液
溶液（水或者其它溶液）應該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強大但非絕對的RNase抑制劑，它通過共價修飾RNase發(fā)揮作用。
重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產(chǎn)品廠商提供的相應安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。
不含RNase的溶液的制備
溶液（水或者其它溶液）應該使用0.1%的DEPC處理。DEPC是一種強大但非絕對的RNase抑制劑。濃度為0.1%的DEPC經(jīng)常用于處理玻璃或者塑料耗材，以使其表面的RNase失活，或者制備不含RNase的的溶液和水。DEPC通過共價修飾使RNase失活。在100 ml要處理的溶液中加入0.1 ml DEPC，大力的搖晃，以使DEPC充分進入溶液。將溶液在37°C的條件下孵育12個小時。在高壓滅菌器內(nèi)處理15 min以去除任何DEPC的痕跡。DEPC與伯胺發(fā)生反應，因此不能直接用于處理Tris緩沖液。在Tris緩沖液存在的條件下，DEPC非常不穩(wěn)定，迅速分解為乙醇和CO2。在制備Tris緩沖液時，應先使用DEPC處理水，然后將Tris溶解以制備合適的緩沖液。痕量的DEPC會通過乙酰基化作用，與RNA分子中的嘌呤殘基反應，將其修飾。在細胞外的環(huán)境中，乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻譯。但是，除非有大量的嘌呤殘基被修飾了，否則不會嚴重的影響這些RNA分子雜交形成DNA：RNA或者RNA：RNA雜交物的能力。溶液或者器皿上殘留的DEPC，一定要在高壓滅菌器中處理或者加熱到100°C處理15 min，以便除去。
重要：在使用化學試劑時，一定要穿戴合適的實驗工作服，一次性的手套以及護目鏡。請參考產(chǎn)品廠商提供的相應安全數(shù)據(jù)說明書（SDS），了解更多信息。
生物樣本中RNA的穩(wěn)定處理
為了確保基因表達分析的精確性，所分析的RNA應能夠準確地反映出其在生物樣本中的體內(nèi)表達情況。但實際在樣本的操作和RNA的分離過程中，RNA很容易發(fā)生改變而使情況變得復雜。
生物樣本一經(jīng)提取，其中的RNA即變得極不穩(wěn)定。期間所發(fā)生的人為影響主要分成兩種。基因的下調(diào)和RNA的酶促降解會導致mRNA特異性或非特異地發(fā)生人為降低。同時在操作和加工樣本的過程中，某些基因會被誘導表達。這兩種效應的綜合可能在檢出的轉(zhuǎn)錄譜與體內(nèi)真實情況之間造成偏差。
對RNA表達譜進行即刻的穩(wěn)定化處理是精確基因表達分析中的首要事項。通常情況下，用于RNA分析的樣本被迅速置于液氮中冷凍，在進一步處理之前一直儲存于–80°C下。產(chǎn)品供應商也提供了一些穩(wěn)定處理試劑，作為替代方法對生物樣本中的RNA進行穩(wěn)定化處理。這些供應商提供了集成化的樣本處理溶液（套裝），其中包括容器，穩(wěn)定處理試劑及制備試劑盒。
RNA的大小和分子量
E. coli
tRNA
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
|
75
120
1541
2904
|
2.6 x 104
4.1 x 104
5.2 x 105
9.9 x 105
|
果蠅
18S rRNA
28S rRNA
|
1976
3898
|
6.7 x 105
1.3 x 106
|
小鼠
18S rRNA
28S rRNA
|
1869
4712
|
6.4 x 105
1.6 x 106
|
兔子
18S rRNA
28S rRNA
|
2366
6333
|
8.0 x 105
2.2 x 106
|
人
18S rRNA
28S rRNA
|
1868
5025
|
6.4 x 105
1.7 x 106
|
換算為核酸：RNA
RNA分子量和摩爾換算
-
單鏈RNA分子的MW（鈉鹽）= (堿基數(shù)量) x (343道爾頓/堿基)
|
1.0
|
1.67
|
1.0 x 1012
|
|
0.6
|
1.0
|
1.0 x 1011
|
RNA分離：起始材料的破碎和勻漿
起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總DNA分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨立分開的步驟。
-
破碎：對于組織結(jié)構、細胞壁和細胞質(zhì)膜的徹底破碎對于釋放樣本中所有的RNA是絕對必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達到徹底的破碎效果。不完全的破碎會導致RNA得率的顯著降低。
-
勻漿：勻漿對于減少破碎后細胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷高分子量的基因組DNA及其他高分子量的細胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠徹底會導致RNA結(jié)合效率的下降而顯著降低得率。
某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進行破碎和勻漿的準則全面概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時，該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進行更為詳細的論述。
使用玻珠研磨機進行破碎和勻漿
在使用玻珠研磨機破碎樣本的過程中，樣本與珠子被一起進行高速攪拌。通過珠子與細胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有：
-
珠子的大小和組成
-
緩沖液與珠子的比例
-
起始樣本的數(shù)量
-
攪拌速度和設定
-
處理時間
細菌破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細胞動物細胞時為0.5毫米的玻璃珠，對動植物組織則應使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預先潤洗。或者可直接購買和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每一應用的經(jīng)驗進行設定。植物材料以及相關的珠子和破碎管可先在液氮中預冷，破碎應在無裂解緩沖液的條件下進行。對于動物組織則應使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無論是在玻珠研磨機中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會對樣本同時起到勻漿作用。
使用轉(zhuǎn)子——定子勻漿器進行破碎和勻漿
在裂解緩沖液的存在下，轉(zhuǎn)子–定子勻漿機可同時完成對動物組織的徹底破碎和勻漿，所需時間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內(nèi)完成。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機也可以用于細胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉(zhuǎn)子的超高速旋轉(zhuǎn)能夠以擾動和機械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當大小的管子，在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部一直處于浸沒狀態(tài)，并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達到最少。轉(zhuǎn)子–定子勻漿機有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 μl以下的體積內(nèi)使用，并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。
使用研缽和杵破碎
使用研缽和杵破碎時，先將樣本進行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉(zhuǎn)移至液氮預冷的適當大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進行后續(xù)步驟。
注：使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品，但無法達到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進行。
使用注射器和針頭完成勻漿
細胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進行勻漿。可以使用20號（0.9 mm）針頭連接一個滅菌塑料注射器，通過至少5–10次的吹打切斷高分子量的DNA，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。
|
培養(yǎng)的動物細胞
|
加入裂解緩沖液
|
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機或注射器和針頭獲取胞質(zhì)RNA
|
如果處理少于1x105個細胞，可以使用渦動勻漿裂解產(chǎn)物。不提供勻漿方案。
|
|
動物組織
|
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
|
轉(zhuǎn)子–定子勻漿機
|
同步進行破碎和勻漿
|
|
動物組織
|
研缽和杵
|
注射器和針頭
|
使用轉(zhuǎn)子–定子勻漿機和玻珠研磨機通常比使用研缽和杵的得率更高。
|
|
動物組織
|
玻珠研磨機
|
玻珠研磨機
|
|
|
細菌
|
加入裂解緩沖液進行酶（溶菌酶）解
|
渦旋機
|
如果處理大于5x108個細胞，使用注射器和針頭進行勻漿可能會增加得率。
|
|
細菌
|
玻珠研磨機
|
玻珠研磨機
|
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
|
|
酵母
|
酶解（溶菌酶/消解酶）細胞壁后加入裂解緩沖液，以消化原生質(zhì)球。
|
渦旋機
|
|
|
酵母
|
玻珠研磨機
|
玻珠研磨機
|
玻珠研磨機可同時完成破碎和勻漿；不能使用渦動操作代替玻珠研磨機。
|
|
植物和絲狀真菌
|
研缽和杵
|
注射器和針頭
|
研缽和杵不能代替轉(zhuǎn)子–定子勻漿機。
|
從不同樣本來源分離RNA的特別注意事項
一些樣本來源在其RNA或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導致RNA的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當操作這些樣本來源時需要一些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進行探討。
植物
從植物材料中分離RNA會遇到一些特殊困難，常規(guī)技術在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)與核酸相似，導致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。（使用不當?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或苯酚）所導致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的RNA的共分離，可能造成對酶促反應的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結(jié)果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導致的吸取體積錯誤，以及儲存過程中的RNA降解問題。
通常對植物的生長條件進行優(yōu)化，使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對RNA的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對其生長條件很難有同一的指導標準。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織，因為前者在等重條件下通常比后者包含更多的細胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進行收獲，以避免形成植物代謝物的高水平積累。
心臟、肌肉和皮膚組織
從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類的樣本中分離RNA可能比較困難，因為此類樣品中含有大量的收縮性蛋白、結(jié)締組織和膠原。為了去除這些可能對RNA分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對此類樣本進行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免RNA發(fā)生降解。
細菌
細菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒有5'帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無法通過雜交進行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用隨機引物作為替代。
此外，細菌RNA也十分地不穩(wěn)定，快速生長的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些細菌的mRNA在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從細菌中分離mRNA的研究人員來說，這可算是一個大麻煩。也由于細菌中的mRNA的周轉(zhuǎn)（從生成到降解）非常快，造成原核生物的基因表達研究比真核生物更為困難。為了精確地保留基因表達譜，并使完好mRNA的得率最大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進行穩(wěn)定處理。
血液
血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的RNA分析造成干擾。此外，如肝素和EDTA等一類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應注意抗凝血劑并不會對RNA起到穩(wěn)定化作用。
人類血液中的紅血球（血紅細胞）不含細胞核，因此不會合成RNA；通常情況下這類細胞僅含有非常微量的RNA，而不是RNA分離的主要對象。從全血中分離RNA的主要靶標細胞為白血球（白細胞），這類細胞含有細胞核和RNA。白血球由三種主要的細胞類型構成：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。
由于健康的血液中所含的紅細胞數(shù)量約為白細胞的1000倍，去除紅細胞會有助于簡化RNA分離步驟。可通過選擇性地裂解紅細胞來達到此目的，因為紅細胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。
裂解紅細胞的另一種常見替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，F(xiàn)icoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細胞（淋巴細胞和單核細胞），而會去除粒細胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細胞能夠使用與其他動物細胞一樣的方法進行RNA分離。
FFPE組織樣品
福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫(yī)學研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對FFPE樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的獨特屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。
由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴重的片段化和化學改變。因此，從FFPE樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實驗室（lab–on–a–chip）分析等標準質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況，但后者實際會對酶學分析造成嚴重干擾。
為了將FFPE儲存法對RNA轉(zhuǎn)錄物的影響降至最低，應牢記下列小貼士：
-
盡可能快地取樣和固定組織
-
不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時間不宜過長（最長24小時）
-
使用優(yōu)質(zhì)的試劑進行石蠟包埋，不要加入其它添加劑
-
盡可能避免對樣本進行染色
-
適當?shù)貎Υ鍲FPE樣本（RNA在4°C可完好保存至1年，優(yōu)于保存在室溫或更高溫度）
-
使用適當?shù)拿撌灢襟E
-
RNA分離應包含一個解交聯(lián)的步驟
RNA病毒
一些病毒含有單鏈或雙鏈的RNA基因組。RNA病毒通常從無細胞的體液中得到分離，在這類樣本中它們的滴度非常之低。在進行RNA的分離之前，病毒顆粒可能需要超速離心、超濾作用或沉淀步驟進行濃縮。在RNA的分離過程中如果預期得率很低，則可能需要加入載體RNA。
病毒RNA的主要問題在于其通常具有復雜的二級結(jié)構。這使下游分析變得異常困難。許多逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄過程難于通過復雜的RNA二級結(jié)構。另外，RNA病毒還具有較高的突變率，因為它們的復制過程并不精確。這樣就很難獲得均一的成分用于后續(xù)分析。
血漿或血清（或其他體液樣本）中的游離RNA
在血漿、血清、尿液、其他體液以及細胞培養(yǎng)上清中都存在著與蛋白脂質(zhì)（囊泡）或蛋白質(zhì)相結(jié)合的RNA，特別是miRNA。 這些RNA的濃度大大低于細胞內(nèi)的RNA，但比人類血漿中的游離DNA濃度要高大約10倍。在人體血液中RNA相對穩(wěn)定，半衰期為2天左右。盡管如此，RNA在反復凍融的條件下依然會降解。當分離體液中的游離病毒RNA時，可能有必要加入載體RNA。
|
Adenoviridae
|
Adenovirus
|
dsDNA
|
|
Arenaviridae
|
Lassa virus
|
ssRNA
|
|
Bornaviridae
|
Borna disease virus
|
ssRNA
|
|
Bunyaviridae
|
Hantaan virus
|
ssRNA
|
|
Caliciviridae
|
Hepatitis E virus, Norwalk virus
|
ssRNA
|
|
Filoviridae
|
Ebola virus
|
ssRNA
|
|
Flaviviridae
|
Hepatitis C and G viruses, Dengue virus
|
ssRNA
|
|
Hepadnaviridae
|
Hepatitis B virus
|
ss/dsDNA
|
|
Herpesviridae
|
Herpesviruses (HSV; CMV; EBV; HHV6, 7, 8)
|
dsDNA
|
|
Papovaviridae
|
Human papillomavirus, JC virus
|
ssDNA
|
|
Paramyxoviridae
|
Parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus
|
ssRNA
|
|
Parvoviridae
|
Parvovirus B19 (erythrovirus)
|
ssDNA
|
|
Picornaviridae
|
Coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, poliovirus, rhinovirus
|
ssRNA
|
|
Reoviridae
|
Rotavirus
|
dsRNA
|
|
Retroviridae
|
Human foamy virus, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus
|
ssRNA
|
|
Rhabdoviridae
|
Rabies virus
|
ssRNA
|
RNA的儲存
純RNA可以儲存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述條件下，1年內(nèi)都不會發(fā)生RNA降解。
RNA定量
參見“使用分光光度法測定RNA濃度”。正如“確定RNA的品質(zhì)”中所述，260 nm與280 nm波長的吸光度之間的比值能夠指示RNA的純度。
微量（或微滴）紫外讀取器（例如Nanodrop）也經(jīng)常用來確定RNA濃度。
在檢測RNA樣本時，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。該條件可通過使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。
使用分光光度法測定RNA濃度
在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計中，測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結(jié)果，讀值應在0.15與1.0之間。在260 nm波長下，1個單位的吸光值對應每毫升44 μg的RNA濃度（A260=1 → 44 μg/ml；基于標準的1 cm測光距離）。這一相關性僅對中性pH值條件下的檢測有效。因此，如需稀釋RNA樣品，則應使用中性pH值的低鹽緩沖液（例如10 mM Tris?Cl ，pH7.0）。
在檢測RNA樣本時，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。列舉一個RNA定量中的計算實例如下：
RNA定量舉例
RNA樣品的體積= 100 μl
稀釋=10 μl RNA樣品+490μl 10 mM Tris?Cl ，pH 7.0（1/50的稀釋比）
使用1 ml（已去除RNA酶）比色杯，檢測稀釋后樣本的吸光度
A260 = 0.2
RNA濃度
= 44 μg/ml x A260 x稀釋系數(shù)
= 44 μg/ml x 0.2 x 50
= 440 μg/ml
RNA總量
=濃度x以毫升為單位的樣品體積
= 440 μg/ml x 0.1 ml
= 44 μg RNA
確定RNA的品質(zhì)
RNA純度
在260 nm與280 nm讀值之間的比例（A260/A280）能夠反映RNA的純度，因為如蛋白一類的污染物會吸收紫外光。不過，A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當使用沒有緩沖能力的水時，pH值與A260/A280的比值結(jié)果都會發(fā)生大范圍的改變。 較低的pH值會導致A260/A280的比值變小，對蛋白質(zhì)污染的敏感性也會隨之降低（3）。
為了獲得精確的比率，我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度（例如10 mM Tris?Cl，pH7.5）。在10 mM Tris?Cl，pH 7.5緩沖液當中，純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。
注：某些分光光度計在檢測純RNA時，可常規(guī)獲得高達2.3的比值。
請確保使用同種溶液校準分光光度計。不過，為了準確確定RNA的濃度，我們?nèi)越ㄗh使用中性緩沖液稀釋RNA樣本，因為吸光度和濃度（A260讀值為1相當于44 μg/ml的RNA濃度）之間的關系是一個基于中性條件獲得的吸光系數(shù)。
RNA的完整度
總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統(tǒng)（如QIAxcel系統(tǒng)或Agilent 2100 ）進行檢測。每條核糖體RNA的富集區(qū)域在凝膠染色之后應顯現(xiàn)為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現(xiàn)小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因為RNA樣品在制備過程中發(fā)生了嚴重的降解。
Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數(shù)目（RNA Integrity Number，RIN）這一參數(shù)，作為對RNA完整度的一個有用量度。在理想情況下RIN值應接近10，不過在許多情況下（特別是對組織樣本來說），RNA品質(zhì)主要取決于原始樣本的保存情況。
|
E. coli
|
16S
23S
|
1.5
2.9
|
|
S. cerevisiae
|
18S
26S
|
2.0
3.8
|
|
小鼠
|
18S
28S
|
1.9
4.7
|
|
人
|
18S
28S
|
1.9
5.0
|
RNA分析：分析凝膠
變性凝膠分析的原理
利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應，可對RNA進行分離和鑒定。RNA不像DNA，它們具有復雜的二級結(jié)構，因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級結(jié)構，從而使得RNA分子嚴格按照電荷遷移的方式得到有效分離。
在電場中，主鏈磷酸基團上所攜帶的負電荷使核酸分子向陽極移動。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大小；不過片段大小與遷移速率之間并非線性相關，因為更大的片段會遇到更大的摩擦阻力，在凝膠中移動更為困難。
瓊脂糖凝膠分析是最為常用的RNA分析方法，通常依據(jù)RNA的大小相應選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段，如tRNA或5S rRNA，可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。可查閱分子生物學手冊（2,4）以獲得關于各類分析膠的詳細信息。本節(jié)將針對甲醛瓊脂糖凝膠電泳進行介紹。
制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠
下列甲醛瓊脂糖（FA）凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續(xù)檢測（例如RNA印跡）的靈敏度。本方案的關鍵特點在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液，從而（相比傳統(tǒng)實驗方案）能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。
瓊脂糖
用于制備凝膠的瓊脂糖是針對所分離RNA片段的大小來確定濃度范圍的。對于大多數(shù)的目的RNA種類來說，使用1.0–1.2%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖濃度可獲得最佳結(jié)果。對于較大的mRNA種類，降低瓊脂糖濃度可能會有所幫助。如需分離更小的mRNA，瓊脂糖濃度可提高至2%。對于較小的RNA種類，如tRNA或rRNA，則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。
請使用超純瓊脂糖，因為如多糖類、鹽類和蛋白一類的雜質(zhì)都會對RNA的遷移造成影響。
小貼士：某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當留意，并核對廠商的說明書。
制膠
-
制備足夠的10x FA凝膠緩沖液用于制膠，配制足夠的FA凝膠電泳緩沖液以裝滿整個電泳槽。
-
將適量的瓊脂糖、10xFA凝膠緩沖液，以及不含RNase的的水在培養(yǎng)瓶或燒瓶中混合。
制備尺寸為10x14x0.7 cm的FA凝膠，請混合以下試劑：
1.0–1.2 g 瓊脂糖
10 ml 10x FA凝膠緩沖液
加入不含RNase的的水至100 ml
混合物的體積不要超過容器的一半。將容器封口以避免蒸發(fā)。
小貼士：如需配制更小或更大的凝膠，請按比例調(diào)整組分的用量。
-
在微波爐或沸水浴中加熱混合物，偶爾搖動混合物容器直至瓊脂糖完全溶解。
小貼士：請確保燒瓶蓋為松弛狀態(tài)以避免壓力過高。請小心避免瓊脂糖溶液過熱導致沸騰溢出。
小貼士：如果在加熱過程中液體體積由于蒸發(fā)作用而明顯變少，可使用不含RNase的的蒸餾水補充至原體積。這將保證瓊脂糖濃度的準確性。
-
將瓊脂糖溶液在水浴中降溫至65–70°C。偶爾搖動或渦動溶液，以避免發(fā)生不均勻冷卻的現(xiàn)象。
-
冷卻后，加入1.8 ml 37%（12.3 M）的甲醛和1 μl 10 mg/ml的溴化乙錠母液。
小貼士：甲醛有毒。請在通風櫥中操作以避免吸入。操作時請佩戴手套并使用適當?shù)陌踩A防措施。
小貼士：在加入甲醛和溴化乙錠之前，請確保溶液已充分冷卻。如果溶液仍過熱，甲醛會變質(zhì)甚至失效。
小貼士：凝膠中的溴化乙錠使RNA在紫外光下變得可見。溴化乙錠有毒并具有強力誘變作用。操作時請佩戴手套并使用適當?shù)陌踩A防措施。建議使用丁腈手套，因為乳膠手套無法提供完全的防護。使用后應按照常用手冊中的說明，對溴化乙錠溶液進行凈化處理。
小貼士：溴化乙錠母液（一般為10 mg/ml的水溶液）應置于深色瓶或包有鋁箔的瓶中，并儲存于2–8°C的條件下。
-
在通風櫥內(nèi)將瓊脂糖溶液倒入3–5 mm厚的凝膠盤中。在倒膠之前或之后迅速插入梳子。放置凝膠使其冷卻至少30分鐘。
小貼士：請確保梳子底部和凝膠盤之間留有足夠的間距（0.5–1.0 mm），以形成完整的樣品孔和避免樣品滲漏。
小貼士：請確保凝膠或樣品孔之間無任何氣泡。在凝膠冷卻凝固之前可以使用巴斯德吸管將氣泡小心除去。
小貼士：可以配制更厚的凝膠，方便更大樣本量的載入。更薄的凝膠在RNA印跡當中的轉(zhuǎn)印效果更優(yōu)，不過載入的樣本量也更小。
小貼士：梳子的厚度會影響凝膠中條帶的銳度。更薄的梳子形成的條帶更為銳利，不過每個樣品孔中能夠載入的樣品量也更少。
-
將凝膠放置于電泳槽內(nèi)，期間不要拔出梳子。向電泳槽內(nèi)添入1xFA凝膠電泳緩沖液。
小貼士：加入足夠的緩沖液以確保凝膠上覆蓋有1 mm深度的緩沖液。如果加入了過多的緩沖液，則電流將直接通過緩沖液而很少通過凝膠。
-
從凝膠中小心拔去梳子。在運行電泳前，讓凝膠在1xFA凝膠電泳緩沖液中平衡至少30分鐘。
|
20 mM MOPS
|
MOPS fre acid
|
41.9 g
|
|
5 mM醋酸鈉
|
醋酸鈉·H2O
|
6.8 g?
|
|
1 mM EDTA
|
0.5 M EDTA, pH 8.0
|
20 ml
|
|
1x FA凝膠緩沖液
|
10x FA凝膠緩沖液
|
100 ml
|
|
2.5 M甲醛*
|
37% (12.3 M) 甲醛
|
20 ml
|
|
–
|
不含RNase的水?
|
880 ml
|
對RNA的甲醛變性凝膠電泳及分析
RNA上樣緩沖液
向凝膠上樣之前，須向樣品中加入RNA上樣緩沖液。上樣緩沖液的作用主要有三個：
-
上樣之前對RNA樣本進行變性。
-
增加樣本的密度，確保其在上樣過程中沉入樣品孔底部。
-
使用染料為樣品上色，幫助上樣并對電泳過程起到顯像和指導作用。
濃縮的RNA上樣緩沖液的關鍵特點在于，（與傳統(tǒng)方法相比）它能夠有助于向凝膠中載入更大數(shù)量的RNA樣本。
|
0.25%溴酚藍
|
溴酚藍
|
25 mg*
|
|
4 mM EDTA
|
0.5 M EDTA, pH 8.0
|
80 μl
|
|
0.9 M 甲醛?
|
37% (12.3 M) 甲醛
|
750 μl
|
|
20%甘油
|
甘油
|
2 ml
|
|
30.1%甲酰胺
|
甲酰胺
|
3.084 ml
|
|
4x FA凝膠緩沖液
|
10x FA凝膠緩沖液
|
4 ml
|
電泳緩沖液
RNA凝膠的電泳條件比DNA凝膠的pH值更低，因為RNA的pKa值低于DNA。此外，RNA不同于DNA，其在高pH條件下容易發(fā)生堿性裂解。因此RNA凝膠應于中性pH條件下進行電泳。MOPS（3-(N-嗎啡啉)丙磺酸）是RNA凝膠最為常用的緩沖體系，因為它在pH 7.0具有很強的緩沖能力。電泳緩沖液中所含的甲醛能夠保持RNA處于變性狀態(tài)。瓊脂糖凝膠中也需含有甲醛。
注：電泳槽應使用洗滌液（例如0.5%的SDS）進行清洗，之后使用不含RNase的的水徹底漂洗，并換用乙醇漂洗和干燥。不過某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當留意，并查閱廠商說明書。
電泳的樣本制備
-
向4倍體積的RNA樣品中加入1倍體積的5x RNA上樣緩沖液（例如5 μl上樣緩沖液和20 μl RNA），并混勻。
向凝膠中上樣之前一定在樣品中混合RNA上樣緩沖液。
小貼士：加入的樣品體積最好不要接近樣品孔的承載能力，否則樣品可能會溢出到鄰近的樣品孔中。
小貼士：請確定所有的樣品都具有相同的緩沖液成份。高鹽會延遲RNA分子的遷移。
小貼士：請確保使用不含乙醇的樣品，例如，使用經(jīng)純化的RNA樣品。
小貼士：乙醇可能導致樣品漂出上樣孔。
-
在65°C孵育3–5分鐘以變性RNA。再置于冰上冷卻。
電泳
-
向凝膠的上樣孔中載入變性樣品。上樣之前凝膠應浸沒在電泳槽內(nèi)的電泳緩沖液中。
小貼士：上樣之前，通過電泳緩沖液的沖洗來清除上樣孔中的氣泡。
小貼士：請確保整塊膠都浸沒于FA凝膠電泳緩沖液當中。
小貼士：在上樣過程中，將槍頭尖插入樣品孔底部進行上樣，緩慢排除孔中的液體。留意不要讓槍頭尖損傷到凝膠。
小貼士：樣品一旦上樣完成就不要再移動凝膠盤/電泳槽，以防止樣品從孔中溢出。
小貼士：請確保至少在一個泳道中上樣了適當?shù)姆肿恿繕擞浳铩?
-
連上電泳儀的電極，使RNA向陽極或正極導線（通常為紅色）移動。
小貼士：電泳儀應一直蓋嚴以防止發(fā)生觸電。
小貼士：在通風櫥內(nèi)進行凝膠電泳，以避免使實驗人員暴露于凝膠和緩沖液揮發(fā)出的甲醛中。
-
開啟電源，在5–7 V/cm的電場強度下進行電泳，直至溴酚藍染料電泳至凝膠約2/3處。
小貼士：避免使用過高的電壓，后者可能導致RNA條帶的拖尾和彌散現(xiàn)象的發(fā)生。
小貼士：在電泳過程中定期對緩沖液的溫度進行監(jiān)控。高溫可能導致凝膠部分融化和條帶變形。如果緩沖液變得很熱，則需降低電壓。
小貼士：如果電泳時間很長（如過夜電泳），可使用一個液體泵來循環(huán)利用緩沖液。
凝膠成像分析
凝膠中的溴化乙錠能夠使RNA在紫外光下顯影。使用過后的溴化乙錠溶液應依照常用手冊中的說明（2,4）進行凈化。
溴化乙錠母液（一般為10 mg/ml的水溶液）應置于深色瓶或包有鋁箔的瓶中，并儲存于2–8°C的條件下。
成像
在溶液中溴化乙錠——RNA復合物能夠發(fā)出比未結(jié)合的染料發(fā)出更強的熒光。這意味著在紫外光（254–366 nm）的照射下，已著色膠上的RNA條帶將會在未結(jié)合染料的本底中顯現(xiàn)出來。凝膠圖像可以通過利用寶麗來照片或凝膠記錄系統(tǒng)進行存檔。
小貼士：紫外線會損傷眼睛和皮膚。當在紫外光下工作時，請保持使用適當?shù)难劬兔娌糠雷o措施。
小貼士：紫外線會損傷RNA。如果后續(xù)需要從凝膠中提取RNA，則應盡可能使用低強度的紫外線光源，并使RNA暴露于紫外線的時間達到最短。
分析總RNA
總RNA的完整度和大小分布可以通過觀察著色RNA得到分析。在著色膠中每一種核糖體RNA都應顯示為一條銳利的條帶。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現(xiàn)小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因為RNA樣品在制備過程中發(fā)生了嚴重的降解。28S核糖體RNA的信號強度應約為18S核糖體RNA條帶的兩倍左右。由于28S rRNA相比18S rRNA更加不穩(wěn)定，如果兩者的條帶強度相當，則表明RNA樣品發(fā)生了一定程度的降解。
RNA分析：Northern印跡
在變性凝膠中基于電荷遷移法分離RNA分子之后，可通過毛細管轉(zhuǎn)印法將凝膠中的RNA分子轉(zhuǎn)印至尼龍膜或硝酸纖維素膜上。可使用放射性或化學發(fā)光探針雜交檢測目的RNA，并通過放射性自顯影或拍照進行成像。
由于DNA印跡法以其發(fā)明人E. M. Southern的名字命名為“Southern印跡”，與其相似的RNA印跡法即被稱之為“Northern印跡”。
Northern印跡的實驗流程
以下為RNA印跡法的一個具體實驗方案。該流程針對標準的甲醛瓊脂糖凝膠進行設計，制備和電泳過程參見“RNA分析：分析膠”。
印跡膜
RNA印跡法中通常將RNA固著于尼龍膜或硝酸纖維素膜上。一般推薦使用正電性的尼龍膜，因為它們的強度和操作性都優(yōu)于硝酸纖維素膜。
小貼士：在操作印跡膜時請一直佩戴手套。從膜的邊緣，或使用鈍頭鑷子小心操作印跡膜。
轉(zhuǎn)印緩沖液
甲醛瓊脂糖RNA凝膠通常在如20xSSC一類的高鹽緩沖條件下進行轉(zhuǎn)印。請制備1.2公升的20xSSC溶液。如需配置更大的RNA凝膠（大于100 ml體積），則需制備2.4公升20xSSC溶液。
小貼士：吸取200 ml體積的20xSSC溶液，稀釋兩倍以獲得10xSSC溶液，用于轉(zhuǎn)印后RNA印跡膜的浸泡和洗滌。
|
3 M NaCl
|
NaCl
|
175.3 g
|
|
0.3 M檸檬酸鈉
|
檸檬酸鈉·2H2O
|
88.2 g
|
所需儀器
-
Whatman 3MM濾紙
-
15–20 cm左右厚度的一摞紙巾
-
塑料薄膜
-
兩塊玻璃板或有機玻璃板
-
能夠裝載1–2公升緩沖液的托盤（例如玻璃焙盤）
-
1公斤左右的平板重物
-
不含RNase的的水（200 ml）
-
0.05 M NaOH（200 ml）
預先浸泡濾紙和印跡膜
-
以每邊大于凝膠1 mm的尺寸，切取一片尼龍膜和兩片Whatman 3 mm濾紙。
-
切取比凝膠長兩倍的Whatman紙，確保凝膠下的濾紙長度能夠接觸到轉(zhuǎn)印盤兩側(cè)的底部。
-
將尼龍膜在水中潤濕。之后將Watman紙與尼龍膜共同浸泡于20xSSC溶液中1–2分鐘。
毛細管轉(zhuǎn)印
-
使用1公升20xSSC將緩沖液托盤填滿。將玻璃或有機玻璃板放置于托盤內(nèi)或支持物的頂端。
-
將預先浸泡的兩倍長度濾紙放置于玻璃板或有機玻板之上，使其能夠接觸到轉(zhuǎn)印盤的兩端底部。通過使用移液管在表面來回滾動數(shù)次，趕去濾紙與平板之間存在的任何氣泡。
-
在電泳后立即將凝膠在200 ml不含RNase的水中浸泡10分鐘，之后再于200 ml 0.05 M NaOH中孵育15分鐘，并在浸泡過程伴隨輕柔的搖動。最后于200 ml 10xSSC中浸泡凝膠10分鐘以中和NaOH。
小貼士：將20xSSC 2倍稀釋，以獲得10xSSC溶液。
小貼士：凝膠中包含變性RNA的甲醛。甲醛有毒。請在通風櫥內(nèi)進行操作以避免吸入甲醛。佩戴手套并采取適當?shù)陌踩A防措施。
-
將凝膠朝下放置于平板濾紙之上。
-
在凝膠上方放置一張塑料薄膜。使用足夠大的薄膜以覆蓋整個平板上的濾紙表面。 使用潔凈的解剖刀或刀片，小心地切割凝膠周圍的塑料薄膜。之后移去凝膠上方的塑料薄膜而保留凝膠周圍的薄膜。這項操作能夠確保轉(zhuǎn)印緩沖液僅通過凝膠進行轉(zhuǎn)印移動，而不會在凝膠周圍發(fā)生轉(zhuǎn)移。
-
將預先浸泡的尼龍膜放置于凝膠之上，覆蓋整個凝膠表面。尼龍膜一旦放置好就不要再進行移動。將一根移液管在表面來回地輕柔滾動數(shù)次，以去除尼龍膜與凝膠之間的任何氣泡。
-
將兩塊預先浸泡的Whatman 3mm濾紙放置于尼龍膜表面。再次將移液管于表面來回地輕柔滾動數(shù)次，以去除任何氣泡。
-
在濾紙頂端再放置15–20 cm厚的干燥紙巾。
小貼士：請確保凝膠周圍的塑料薄膜避免了干燥紙巾與凝膠下方的濕潤濾紙及轉(zhuǎn)印緩沖液的直接接觸。注意不要讓紙巾垂下，因為它們會導致液體從凝膠周圍流過而不再通過凝膠。
-
在紙巾上放置第二塊玻板或有機玻璃板。并在平板上方放置1 kg的重物。
-
轉(zhuǎn)印過程需持續(xù)12–18小時。
小貼士：在轉(zhuǎn)印過程中至少移去濕潤的紙巾一次，并更換為干燥的紙巾。必要時向緩沖液盤中加入更多的轉(zhuǎn)印緩沖液。
小貼士：凝膠轉(zhuǎn)印過程中其中所含的甲醛將會擴散出來。甲醛有毒。請在通風櫥內(nèi)進行轉(zhuǎn)印操作，以避免吸入甲醛。在操作過程中穿戴手套并采取適當?shù)陌踩A防措施。
固定RNA印跡
-
轉(zhuǎn)印完成之后，去除重物，紙巾和兩片濾紙。將凝膠和尼龍膜共同翻轉(zhuǎn)過來，使凝膠面向上放置于一篇干燥濾紙之上。使用圓珠筆或較軟的石墨鉛筆在尼龍膜上標記出凝膠泳道的位置。之后剝離并棄去凝膠。
小貼士：請確保在移去凝膠之前在尼龍膜上標記好凝膠泳道的位置！如果忘記進行此項標記，您將無法再確定每一具體泳道的位置。
小貼士：凝膠中的大部分甲醛都被轉(zhuǎn)移至紙巾和上層濾紙當中。
小貼士：請遵照您所在機構的廢品處理準則對廢物進行丟棄。
-
在100–200 ml 10xSSC溶液中潤洗尼龍膜1分鐘。
小貼士：將20xSSC溶液稀釋為10xSSC溶液。這一洗脫步驟將去除任何粘附于RNA印跡上的瓊脂糖成分。
-
通過烘烤（第4步）或紫外線——交聯(lián)法（第5步）將RNA印跡固定下來。
小貼士：紫外線——交聯(lián)法一般能提供比烘烤法更高的靈敏度，從而獲得更好的結(jié)果。不過想獲得適度的交聯(lián)，需要預先優(yōu)化系統(tǒng)條件。
-
通過烘烤來固定RNA時，首先在一片干燥的濾紙上風干RNA印跡膜，之后將其放置于兩片濾紙之間。在80°C的真空烘箱內(nèi)烘烤30分鐘至2個小時。
-
通過紫外線——交聯(lián)法固定RNA時，將潮濕的印跡膜附有RNA的一側(cè)以固定時長暴露于紫外照射（例如使用一臺紫外透射儀）下。
小貼士：為了確定紫外照射的合適條件，首先須對整個系統(tǒng)進行經(jīng)驗性的實驗和優(yōu)化。為了達到此目的，先使用已知RNA成分的樣本制成含多個平行泳道RNA印跡膜。將此印跡膜切割為含單一泳道的條塊，并分別照射從0.5至5分鐘內(nèi)的不同時長。雜交完成后確定何種雜交時間所獲的信號最佳。請確保對每次實驗使用同樣的條件（紫外線波長，與紫外光源的距離）。此外，整個系統(tǒng)應定期進行校準，以保證紫外照射的強度不會發(fā)生改變。
小貼士：紫外線會損傷眼睛和皮膚。請一直佩戴適當?shù)难鄄亢兔娌糠雷o裝置。
-
如果制好的RNA印跡不會立刻使用，請使用塑料薄膜對其進行包裹，并儲存于4°C條件下。
毛細管電泳
RNA分子的完整性對于基因表達分析實驗極其重要，使用完整的RNA是獲得有意義的實驗數(shù)據(jù)的關鍵步驟。
背景
以往通過使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳，獲得28S：18S rRNA的比值，從而來評價RNA分子的完整性。這能產(chǎn)生一種確定的條帶模式（4）。通常，凝膠上會顯示兩個分別對應28S rRNA和18S rRNA的條帶，凝膠上還有其它的條帶，對應更小的RNA分子。當28S：18S rRNA條帶的比值≥2.0時，可認為RNA分子的質(zhì)量很高。
但是，這種方法是易變的；因為這是一種依賴于人肉眼的主觀檢測。因此，這種方法不能在不同的實驗室之間，甚至是同一個實驗室內(nèi)部標準化。
毛細管電泳RNA分離技術的引入，為自動化，標準、清晰的評價RNA樣品的完整性，打下了基礎。
毛細管電泳可以根據(jù)分子的大小快速分離核酸。與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳不同，這種分離是在即用型膠盒中的毛細管中進行的。樣品自動載入到單獨的毛細管中，然后外加電壓。帶負電荷的核酸分子在毛細管中，向帶正電荷的一端遷移。與瓊脂糖凝膠電泳類似，低分子量的分子遷移比高分子量的分子要快。當核酸分子沿毛細管遷移時，經(jīng)過一個檢測器，可以檢測并且測定熒光信號。通過光電倍增管將熒光信號轉(zhuǎn)變成電信號，并傳至電腦上，以便進行進一步的處理。
RNA完整性參數(shù)
可以通過很多方法測定RNA的完整性，包括RNA質(zhì)量指標(RQI)，RNA質(zhì)量評分(RQS)和RNA完整性計數(shù)(RIN)。RIN是目前最為常用的方法。
RNA完整性計數(shù)(RIN)
RNA完整性計數(shù)是幫助科學家估計整個RNA樣品完整性的一種軟件算法。相應軟件會自動為一個真核細胞總RNA樣品的完整性計數(shù)賦值。
這種方法中，樣品的完整性不再通過核糖體RNA條帶的比值來確定，而是通過RNA樣品的整個電泳軌跡來確定。這考慮了降解產(chǎn)物的存在與否對結(jié)果的影響。這種方法可以幫助解析電泳圖譜，實現(xiàn)對樣品的比較，并確保實驗的可重復性。所得到的RIN值，與樣品的濃度、使用的工具和分析方法無關，因此是一種真正的評價RNA物理完整性的標準。
RIN可提供：
-
對RNA完整性的數(shù)值評價
-
RNA樣品的直接比較（比如，不同實驗室之間的比較）
-
實驗的可重復性（比如，如果一個RIN值適用于微陣列實驗，那么只要使用相同的組織和提取方法得到的樣品，相同的RIN值總能適用于相似的實驗）
應用RIN
首先，RIN值必須得到驗證。這可以通過，將RIN值與一個特定的下游實驗（比如微陣列分析或者RT-PCR）相關聯(lián)來實現(xiàn)。這個關聯(lián)步驟可以用來確定，成功的下游實驗和失敗的實驗之間的RIN閾值。如果可能的話，這一步驟可基于已知的Bioanalyzer實驗數(shù)據(jù)集上進行。確定閾值之后，這個閾值就可以用于標準的RNA質(zhì)控流程。具有高于閾值的RIN值的樣品，能通過質(zhì)量控制檢測，而舍棄那些低于閾值的樣品。當重要的實驗參數(shù)改變（包括，研究其他物種，使用其他類型的微陣列，使用不同的探針集等）時，應重復RIN驗證的關聯(lián)步驟。
從RNA中去除基因組DNA污染
目前還沒有哪一種純化步驟能保證RNA中不含DNA，即使在瓊脂糖凝膠電泳上檢測不到DNA。對于低豐度目標序列的研究，殘留的DNA污染物對樣品的任何干擾，都能夠通過real-time RT-PCR 對照實驗檢測到，在這些對照實驗中，PCR反應之前不加入逆轉(zhuǎn)錄酶。為了避免real-time RT-PCR 實驗中DNA的干擾，我們推薦設計與內(nèi)含子的剪接位點相結(jié)合的引物，這樣就避免了基因組DNA的擴增。也可以使用一些商業(yè)化的試劑盒，在cDNA合成時，去除基因組DNA。對于一些靈敏程度更高的應用，推薦使用不包含核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶，對經(jīng)過純化的RNA進行消化，去除DNA。
參考文獻
-
Alberts, B., et al. (2002) Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland Publishing, Inc.
-
Ausubel, F.M. et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons.
-
Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.
-
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
