基因組DNA

質(zhì)粒DNA

處理DNA

DNA的分子量換算

其中N_X = 寡核苷酸內(nèi)各核苷酸殘基數(shù)目（各核苷酸列明的MW為（在相應(yīng)鈉鹽條件下）融合到寡核苷酸內(nèi)的相應(yīng)核苷酸的MW） 
對于脫磷酸化寡核苷酸：P = –84.0 
對于磷酸化寡核苷酸：P = 40.0

DNA的分子換算

DNA的分子換算請見表：微克DNA換算和皮摩爾DNA換算。蛋白質(zhì)/DNA換算請見表：蛋白質(zhì)/DNA換算。

微克DNA換算

1 μg	pmol	分子
20 b寡聚核苷酸	152	9.1 x 1013
1000 bp DNA	1.52	9.1 x 1011
pUC 19 DNA (2686 bp)	0.57	3.4 x 1011
pBR322 DNA (4363 bp)	0.35	2.1 x 1011
Lambda DNA (48,502 bp)	0.03	1.8 x 1010

皮摩爾DNA換算

1 pmol	微克
20 b寡聚核苷酸	0.0066
1000 bp DNA	0.66
pUC 19 DNA (2686 bp)	1.77
pBR322 DNA (4363 bp)	2.88
Lambda DNA (48,502 bp)	32.01

蛋白質(zhì)/DNA換算

1 kb of DNA編碼333 氨基酸@ 3.7 x 10⁴ Daltons.

1 pmol	DNA
10,000 Da	270 bp
30,000 Da	810 bp
100,000 Da	2.7 kb

分光光度法測定DNA濃度

DNA和RNA的濃度應(yīng)通過分光光度計(jì)測定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來測定。出于準(zhǔn)確度需要，260 nm下的吸光度讀數(shù)應(yīng)將至0.15到1.0之間。

在10 mM Tris?Cl、pH 8.5條件下，純凈的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比率為1.8–2.0之間。

A₂₈₀處的強(qiáng)吸光度會造成較低的A₂₆₀/A₂₈₀ 比率，這表示有蛋白質(zhì)等污染物存在。

在270 nm和275 nm處的強(qiáng)吸光度則表示存在污染物苯酚。

在325 nm處的吸光度表示很可能存在溶液或臟污的器皿造成的污染。

260 nm處吸光度的分光光度換算

* 此關(guān)系僅在中性pH下進(jìn)行測定時有效，且基于標(biāo)準(zhǔn)1 cm路徑。相對于基準(zhǔn)1進(jìn)行調(diào)整。

1 A260 unit	濃度 (μg/ml)*
dsDNA	50
ssDNA	33
寡聚核苷酸	20–30

基因組DNA提取之前的樣本儲存

起始材料的質(zhì)量影響著分離的DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。純化來自于新鮮采集的組織和細(xì)胞的基因組DNA時，可以達(dá)到最高的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。如果樣品在采集之后無法即時處理，則可將其儲存在可保留DNA完整度的條件下。總的來說，如果樣品，尤其是動物樣品，在未經(jīng)處理的情況下在2–8°C或–20°C條件下儲存，會造成基因組DNA的產(chǎn)量下降。此外，應(yīng)避免對凍存樣品反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會造成基因組DNA大小變小，同時還會造成病原DNA（例如，病毒DNA）的產(chǎn)量下降。我們將在下文討論不同起始材料建議的儲存方法。

血液

將要儲存的血液樣品中應(yīng)添加抗凝劑。例如，采用肝素或EDA處理的血液樣本可在2–8°C下儲存數(shù)天，或在–20°C或–80°C下儲存數(shù)周。此外，采用ACD溶液B （0.48%檸檬酸，1.32%檸檬酸鈉，1.47%葡萄糖；每6 ml血液使用1 ml）處理的血液樣本，在2–8°C下至少可儲存5天，在–20°C下至少可儲存1個月。如需長期儲存，可準(zhǔn)備血液細(xì)胞核，并在–20°C下儲存。

其它臨床樣本

大多數(shù)生物液（例如，血漿、血清和尿液）和糞便樣本可在2–8°C下儲存數(shù)小時。如需長期儲存，建議在–20°C或–80°C下冰凍。拭子可在室溫下干燥儲存。

福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)是另一種樣本儲存方法，尤其適用于臨床組織樣品。根據(jù)組織類型，生物分子在收集后發(fā)生分解、誘導(dǎo)或改性的速度存在差異。因此，組織切除和固定的操作步驟應(yīng)盡可能簡短、快捷。

組織的固定涉及將樣本放入福爾馬林溶液的步驟，而后者的組分則存在各種差異（常用的10%福爾馬林溶液含有3.7%的甲醛和1–1.5%的甲醇）。由此引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致生物分子之間發(fā)生交聯(lián)，包括核酸之間、蛋白質(zhì)之間以及核算和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。為獲得最優(yōu)的固定結(jié)果，應(yīng)采用中性緩沖的福爾馬林溶液，而非未緩沖或酸性的福爾馬林溶液。中性緩沖液可減緩福爾馬林的降解，目前可以確信的是后者降解的產(chǎn)物會對核酸質(zhì)量造成一定程度的破壞。

為確保最優(yōu)的固定效果，福爾馬林和組織的體積比應(yīng)至少達(dá)到10:1。在處理較小的組織樣本（如針穿刺吸取組織活檢樣本）時，這一目標(biāo)很容易實(shí)現(xiàn)。但在處理體積較大的組織樣本時，用于組織固定的福爾馬林溶液則可能會出現(xiàn)不足。在此情況下，應(yīng)將組織切片之后再進(jìn)行福爾馬林固定。為避免過度固定(overfixation)，組織固定時間應(yīng)不超過24小時。

經(jīng)過福爾馬林固定后，組織樣本將要包埋在石蠟中，這一過程包括幾步。第一步脫水，即采用酒精（通常為乙醇）取代水。接下來兩步為：透明，即采用二甲苯和二甲苯替代物取代酒精；浸蠟：即用石蠟取代二甲苯。最后一步是包埋，即整個組織用石蠟包裹起來。在浸蠟之前，確保組織樣本已完全脫水非常重要，因?yàn)闅埩舻乃謺斐蓸颖窘到狻楸苊饩凭投妆揭蛑笆褂枚赡軘y帶水分，建議始終采用新鮮的酒精和二甲苯。為確保自FFPE樣本恢復(fù)可用的DNA時能獲得最佳恢復(fù)效果，應(yīng)采用較低的解凍溫度解凍石蠟。此外，應(yīng)避免采用含有蜂蠟等添加劑的石蠟，因?yàn)檫@一類添加劑可能會干擾生物分子的恢復(fù)。

動物組織

新鮮采集的組織可以立即冰凍，并在–20°C、–80°C下，或者液氮中儲存。裂解的組織樣本可在室溫下，在適宜的裂解液中儲存數(shù)月。

動物和人體組織也可固定儲存。我們建議您采用酒精和福爾馬林等固定劑；但如果組織在福爾馬林中長期儲存，會導(dǎo)致DNA出現(xiàn)化學(xué)修飾。如果需要從組織中分離DNA，建議不要采用可能會引起交聯(lián)反應(yīng)的固定劑，如鋨酸。此外，還可從石蠟包埋的組織中分離DNA。

動物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)

離心處理采集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吸棄上清液，然后在–20°C或–80°C下儲存細(xì)胞。此外，還可準(zhǔn)備動物細(xì)胞核并在–20°C下儲存。

植物組織

在不影響DNA質(zhì)量或產(chǎn)量的前提下，大多數(shù)植物屬的新鮮葉子和針葉最多可在4°C下儲存24小時。通常意義上講，如果樣本計(jì)劃的儲存時間超出24小時，則應(yīng)在–80°C下儲存。即便如此，仍有部分樣本（如樹芽）可在4°C下儲存數(shù)天。組織在4°C下儲存時，為避免脫水，應(yīng)避免在密閉的容器內(nèi)儲存。較大的樣本（如，樹枝）則可儲存在含有一塊濕潤的紙巾的塑料袋中。

如果凍存樣本的方法不符合實(shí)際情況，則可采用大量方法干燥植物組織，例如硅膠、食品脫水劑或凍干機(jī)(3)。為防止DNA降解，應(yīng)至少在24小時內(nèi)使材料徹底干燥。如需長期儲存，干燥后的樣本應(yīng)在黑暗、室溫、干燥或氣密條件下儲存。根據(jù)樣本的處理方式，植物標(biāo)本和法醫(yī)學(xué)樣本中的DNA可能會存在不同程度的降解。破碎過的植物材料可在室溫下，在適宜的裂解液中儲存數(shù)月。

真菌材料

菌絲應(yīng)直接從培養(yǎng)皿或液體培養(yǎng)液中采集。如從液體培養(yǎng)液中采集，在進(jìn)行DNA分離和儲存前，應(yīng)采用離心法沉淀細(xì)胞，并吸棄上清液。采集的樣本可以直接冷凍或凍干，并在–80°C下儲存。

基因組DNA提取前的樣本破碎

進(jìn)行所有的基因組DNA分離步驟前，必須要進(jìn)行徹底的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞器的破碎和裂解。破碎不完全，會導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度減少。

破碎方法

裂解液

破碎通常包括含有去污劑（用于破壞細(xì)胞膜）和蛋白酶（用于消化蛋白細(xì)胞成分）裂解液的應(yīng)用。所選的蛋白酶取決于所用的裂解液。為有效裂解，部分樣本需要采取額外處理。

使用轉(zhuǎn)子-定子勻漿機(jī)破碎

根據(jù)的樣本粗燥程度，轉(zhuǎn)子-定子勻漿機(jī)可在5–90秒內(nèi)將動物和植物組織徹底破碎。轉(zhuǎn)子以極高的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，以湍流和機(jī)械式剪切組合作用使樣本破碎。應(yīng)選用尺寸適當(dāng)?shù)娜萜鳎３謩驖{器探頭浸入，同時將浸入的探頭置于離心管的一側(cè)，從而將樣本的泡沫量降至最小。定子-轉(zhuǎn)子勻漿機(jī)現(xiàn)具有不同的尺寸規(guī)格，可采用不同規(guī)格的探頭。直徑為5 mm和7 mm的探頭適用于體積不超過300 μl的應(yīng)用，可在微量離心管中勻漿。直徑為10 mm或更高的探頭則需要更大的離心管。

使用研磨機(jī)破碎

采用研磨機(jī)破碎時，樣本將在存在研磨珠的情況下高速攪拌。研磨珠與樣本不斷碰撞過程中，剪切并粉碎樣本，同時進(jìn)行破碎。破碎效果受以下因素影響：

• 研磨珠的大小和成分
• 緩沖液和研磨珠的比率 
• 起始材料的量
• 攪拌器的轉(zhuǎn)速和配置
• 崩解時間 

細(xì)菌最適宜采用的研磨珠為0.1 mm（平均直徑）的玻璃珠，酵母和單細(xì)胞動物細(xì)胞最適宜采用的是0.5 mm的玻璃珠，動物組織最適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼珠，植物和真菌組織最適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼柱或或碳化鎢珠。必須要采用高濃度硝酸對玻璃珠進(jìn)行洗滌預(yù)處理。此外，也可采用市售的酸洗過的玻璃珠子。所有其它破碎參數(shù)則必須根據(jù)各種應(yīng)用，依照經(jīng)驗(yàn)確定。

采用研磨皿和研磨棒破碎

如要用傳統(tǒng)研磨皿和研磨棒進(jìn)行破碎，則應(yīng)用液氮即時冰凍樣品，并在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)末。將上清液（組織粉末和液氮）移到液氮冷卻的適宜尺寸的試管中，在樣本不融解的情況下讓液氮蒸發(fā)。添加裂解液，然后盡可能快速地進(jìn)入分離操作。

從不同樣本源分離基因組DNA的特別注意事項(xiàng)

部分樣本源中含有可導(dǎo)致DNA分離和分析過程出現(xiàn)問題的物質(zhì)。在處理此類樣本源時，需要采取特別注意事項(xiàng)。本部分將討論處理一系列樣本源時的注意事項(xiàng)。

血液

我們會定期采集人類血液樣本以供臨床分析應(yīng)用。血液中含有大量可能干擾下游DNA分析的酶抑制劑。此外，諸如肝素和EDTA等通用抗凝劑還會干擾下游檢測。從血液中分離DNA時，需要具備可提供不含污染物和酶抑制劑的優(yōu)質(zhì)DNA的方法。

在動物體內(nèi)，鳥類、魚、青蛙的紅細(xì)胞（紅血細(xì)胞）含有核酸，因而也含有基因組DNA，而哺乳動物的紅細(xì)胞中則不含這些成分。由于健康的哺乳動物血液中所含的紅細(xì)胞要比含有核酸的白細(xì)胞（白血細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核白細(xì)胞和顆粒性白細(xì)胞）數(shù)量超出近1000倍，在DNA分離之前去除紅細(xì)胞可提高DNA產(chǎn)量。為此可結(jié)合采用幾種方法。其中的一種方法是選擇性溶解紅細(xì)胞：在低滲緩沖液條件下，紅細(xì)胞要比白細(xì)胞更易低滲休克和快速破裂。另一種方法是Ficoll密度梯度離心法，可回收單核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）并去除紅細(xì)胞。此技術(shù)還可去除粒細(xì)胞。第三種方法則是通過在室溫下對全血進(jìn)行3300 x g離心10分鐘，制備全血白細(xì)胞富集級分（即所謂的白細(xì)胞層）。離心之后，會分成三層：上清層為質(zhì)粒；中間層為白細(xì)胞層；底層含有濃縮的紅細(xì)胞。

血液樣本，包括哪些經(jīng)過紅細(xì)胞去除處理的血液樣本，可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。除動物基因組DNA外，也可從血液樣本中分離病毒和細(xì)菌DNA。

其它臨床樣本

進(jìn)行DNA分離時，多數(shù)生物液可采用與血液樣本相同的方式進(jìn)行處理。從糞便樣本中分離DNA較為困難，這是因?yàn)榧S便中通常含有很多可能降解DNA、抑制下游酶反應(yīng)的成分。

動物組織和細(xì)胞培養(yǎng)液

動物細(xì)胞培養(yǎng)液和多數(shù)動物組織可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。為幫助裂解，新鮮或凍存的樣本應(yīng)切成小塊。在裂解前使用勻質(zhì)機(jī)或磨皿和研磨棒進(jìn)行機(jī)械破碎，可縮短裂解時間。骼肌肉、心臟和皮膚組織中含有豐富的收縮蛋白、結(jié)締組織和膠原蛋白，為確保能采用蛋白酶或蛋白酶K進(jìn)行完整消化，在處理這一類組織時要格外小心。

對于固定后的組織，在裂解前應(yīng)去除固定劑。通過用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌組織，可去除福爾馬林成分。從石蠟包埋的組織中去除石蠟的方法與此類似，即先采用二甲苯提取，然后采用酒精洗滌。

酵母細(xì)胞培養(yǎng)液

為消化細(xì)胞壁，酵母細(xì)胞培養(yǎng)液必須先用溶壁酶或酵母裂解酶進(jìn)行處理。處理后的去壁酵母細(xì)胞將采用離心法進(jìn)行收集，然后使用裂解液和蛋白酶K或蛋白酶進(jìn)行裂解。

細(xì)菌DNA

很多細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。部分細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性菌，則需要采用特殊的酶（例如溶菌酶或溶葡萄球菌酶）進(jìn)行預(yù)孵育以裂解牢固堅(jiān)固的多層細(xì)胞壁。

從大量的臨床樣本中，也可分離出細(xì)菌DNA。細(xì)菌細(xì)胞應(yīng)從生物液中沉淀下來，并從細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液中分離DNA。在進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞離心之前，拭子樣本應(yīng)采用殺真菌劑進(jìn)行預(yù)處理。

DNA病毒

在臨床應(yīng)用中，病毒DNA通常（當(dāng)然不是全部）分離自無細(xì)胞的體液，數(shù)量非常少。在通過超速離心、超濾或沉淀法DNA分離之前，可能需要對病毒微粒進(jìn)行濃縮處理。如果預(yù)期DNA產(chǎn)量非常低時，在DNA分離過程中，可能還必須要添加載體DNA。制備整合的病毒DNA時，采取的操作步驟與從相關(guān)樣本中分離基因組DNA的步驟相同。諸如M13和lambda這一類的噬菌體，分離自感染的培養(yǎng)液。在分離病毒DNA之前，必須通過離心方法從培養(yǎng)液中去除細(xì)菌細(xì)胞。

植物

從植物材料中分離DNA時面臨著特殊的挑戰(zhàn)，通用的技術(shù)往往需要適當(dāng)調(diào)整之后才能用于處理植物樣本。部分植物代謝物具有類似于核酸的化學(xué)性質(zhì)，難以從DNA制備物中去除。純化操作引入的共純化代謝物和污染物（如鹽或苯酚）可能抑制酶促反應(yīng)或造成分光光度法測定偏差和凝膠移位。

采用在不會誘發(fā)高水平植物代謝的條件下生長的植物，通常可以改善DNA分離效果。由于植物之間存在巨大的差異，很難籠統(tǒng)地說明適宜采用的生長條件。但仍有一個基本適用的準(zhǔn)則，即在條件允許的情況下，盡量使用健康、年輕的組織。年輕組織的DNA產(chǎn)量通常要高于年老的組織，這是因?yàn)槟贻p組織所含的細(xì)胞數(shù)量通常要多過同等數(shù)量的年老組織。此外，同等重量條件下，年輕組織的代謝量也更少。除此之外，很多“自制”DNA分離方法實(shí)驗(yàn)方案建議在采集前，先使植物在黑暗環(huán)境下生長1–2天，以防止積累較高水平的植物代謝物。

DNA處理：良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范

大腸桿菌（E. coli）株系的生長

良好的微生物學(xué)技術(shù)總是有助于確保最佳的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。為在您的質(zhì)粒制備過程中制備出絕佳的細(xì)菌培養(yǎng)液，需遵循以下步驟。

1. 通過將來自于新鮮的劃線篩選培養(yǎng)皿中的單個菌落接種到2–10 ml含有適當(dāng)?shù)目股氐腖B培養(yǎng)基中，制備酵母劑。充分振蕩的(~300 rpm)的情況下，在37°C下生長約8小時。
   小貼士：請勿從已儲存較長時間的甘油菌原液、瓊脂穿刺培養(yǎng)液或培養(yǎng)皿上直接接種，因?yàn)檫@會造成質(zhì)粒損失或突變。
   小貼士：通常可以在當(dāng)天方便地生長發(fā)酵劑，以便在次日早晨收集過夜生長的較大的培養(yǎng)物。
2. 按照適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒純化實(shí)驗(yàn)方案，將發(fā)酵劑按照1/500到1/1000的比例稀釋到較大體積的篩選LB培養(yǎng)基中。
   為確保充分通風(fēng)，應(yīng)采用容量至少為培養(yǎng)物體積4倍的燒瓶。請勿使培養(yǎng)物的體積超出了實(shí)驗(yàn)方案建議的體積，否則會造成裂解不充分，降低制備物質(zhì)量。 
3. 在充分振蕩(~300 rpm)的情況下，讓培養(yǎng)物在37°C下生長12–16小時（參見下一部分說明）。 
4. 接種12–16小時后，采集細(xì)菌培養(yǎng)液。這一時刻對應(yīng)于從對數(shù)生長期到靜止生產(chǎn)期的過渡階段，此時細(xì)胞密度較高(3–4 x 10⁹/ml)且細(xì)胞內(nèi)的RNA含量較低。如過早采集，由于細(xì)胞密度相對較低，會造成質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量低于預(yù)期。如過晚采集，培養(yǎng)液會因過于老化而造成DNA降解，從而使質(zhì)粒的質(zhì)量和產(chǎn)量都較低。
   小貼士：培養(yǎng)物的生長依賴于若干因素，如宿主株系、質(zhì)粒插入和拷貝數(shù)以及培養(yǎng)基等等。為確定某個體系的最佳采集時間，應(yīng)通過測定OD₆₀₀（參見下一部分說明）來監(jiān)測細(xì)胞密度和培養(yǎng)物生長情況。
5. 采集細(xì)菌培養(yǎng)物時，應(yīng)在4°C下以6000 x g 的速度離心15分鐘。將敞開的離心管倒置，去除所有痕量的上清液，直至培養(yǎng)基已全部倒出。此時余下的細(xì)胞即可遵照適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒純化實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行裂解操作處理。 
   此外，也可在此時暫停裂解操作處理，將離心獲得的細(xì)胞沉淀冷凍保存，之后再進(jìn)行裂解操作。冷凍的細(xì)胞沉淀可在–20°C下保存數(shù)周。

大腸桿菌(E. coli)生長曲線

大腸桿菌(E. coli)培養(yǎng)液的生長曲線可分為幾個階段。第一階段，遲緩期(lag phase)，直接發(fā)生在將發(fā)酵劑接種到新鮮培養(yǎng)基中之后。在這一階段，由于細(xì)菌仍在適應(yīng)新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂比較緩慢。之后細(xì)菌開始更快速地分裂，培養(yǎng)進(jìn)入對數(shù)期(logarithmic (log) phase)（接種之后4–5小時），在這一階段細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長。隨著時間推移，培養(yǎng)基內(nèi)可用的營養(yǎng)物逐漸被消耗，而細(xì)菌釋放的代謝物還會細(xì)菌生長，培養(yǎng)變?yōu)轱柡蜖顟B(tài)，進(jìn)入穩(wěn)定期(stationary phase)（接種后約16小時），在這一階段細(xì)胞密度保持恒定。最后，隨著細(xì)胞開始裂解，活性細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量開始下降，DNA出現(xiàn)部分降解，培養(yǎng)進(jìn)入衰亡期(decline phase)。

大腸桿菌（E. coli）的保存

根據(jù)預(yù)期的儲存時間，可有多種方法儲存大腸桿菌(E. coli)。甘油菌原液和穿刺培養(yǎng)液均可支持細(xì)菌長期儲存，而瓊脂盤則適于短期儲存。各種方法的準(zhǔn)備說明和有益貼士請見下文所述。

甘油原液

大腸桿菌（E. coli）株系可在–70°C下，在15%的甘油原液中儲存數(shù)年。

細(xì)菌甘油原液的制備方法如下：

1. 向2 ml螺旋小瓶中加入0.15 ml甘油(100%)，然后采用高壓滅菌法進(jìn)行滅菌。 
   小貼士：儲存滅菌甘油的小瓶可分批準(zhǔn)備，并在室溫下儲存?zhèn)溆谩?
2. 向盛放預(yù)先滅菌的甘油的小瓶中添加0.85 ml對數(shù)期的大腸桿菌(E. coli)培養(yǎng)液。
3. 充分渦旋振蕩小管，確保細(xì)菌培養(yǎng)液和甘油均勻混合。
4. 冰凍在酒精-干冰浴或液氮中，并在–70°C下儲存。 
   小貼士：請勿反復(fù)凍融甘油原液，否則會降低細(xì)菌活性。
   小貼士：對于較為珍貴的株系，建議分2個原液瓶儲存。
   小貼士：從儲存的株系恢復(fù)時，建議在篩選培養(yǎng)平板上對株系劃線，以檢查抗生素標(biāo)記。

穿刺培養(yǎng)液

大腸桿菌(E. coli)株系還可以穿刺在半固態(tài)瓊脂糖中儲存至多1年。穿刺培養(yǎng)用于在實(shí)驗(yàn)室間運(yùn)輸和遞送細(xì)菌株系。

穿刺培養(yǎng)液的準(zhǔn)備方法如下：

1. 準(zhǔn)備并高壓滅菌LB瓊脂糖（含有0.7%瓊脂糖的標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基）。
2. 將LB瓊脂糖冷卻到50°C以下（手握的時候感覺到溫度適宜），然后添加適當(dāng)?shù)目股亍Ｔ诃傊侨蕴幱谝簯B(tài)時，在無菌條件下向2 ml螺口小瓶中添加1 ml瓊脂糖，然后等待其凝固。
3. 瓊脂糖小瓶可分批準(zhǔn)備，并在室溫下儲存?zhèn)溆谩?
4. 采用滅菌直絲，從新鮮滅菌培養(yǎng)盤中挑起一片菌落，在半固態(tài)瓊脂糖深入穿刺幾次。
5. 保持瓶帽稍稍松動，將小瓶在37°C下孵育8–12小時。
6. 牢牢地密封上小瓶，在黑暗條件下儲存，理想的儲存溫度為4°C。
7. 從儲存的株系恢復(fù)時，建議在篩選培養(yǎng)平板上對株系劃線，以檢查抗生素標(biāo)記。

瓊脂平板

劃線的細(xì)菌平板可采用石蠟密封，在4°C下倒置儲存數(shù)周。為確保篩選標(biāo)記不會丟失，務(wù)必再含有適當(dāng)抗生素的平板上進(jìn)行細(xì)菌劃線。

為獲得分離效果良好的菌落，請按如下所述在瓊脂平板上劃線：

1. 用火焰烘烤絲環(huán)，然后在空余的無菌瓊脂平板上冷卻。
2. 使用一根絲環(huán)，跨過新鮮的瓊脂平板一角在細(xì)菌培養(yǎng)液（來自于甘油原液、穿刺培養(yǎng)物或另一平板上的單個菌落）上劃線。 
3. 再次在火焰上烘烤絲環(huán)并冷卻。使其穿過第一條劃線，然后再次跨過平板的另一角劃線。
4. 重復(fù)上述步驟直至形成某種圖案。
5. 在37°C下倒置孵育12–24小時，直至菌落開始發(fā)育。

從細(xì)菌原液產(chǎn)出液體培養(yǎng)基

圖所示為從儲存的細(xì)菌原液獲得進(jìn)行質(zhì)粒分離的液體培養(yǎng)液必須采取的步驟順序。在使用前，務(wù)必要在篩選平板上對細(xì)菌原液進(jìn)行劃線，以檢查確認(rèn)它們適宜生長攜帶有適當(dāng)抗生素抗性的健康菌落。此類原液中可能會含有制備所用培養(yǎng)液引起的突變，或在儲存過程中可能會品質(zhì)下降。

孵育的液體培養(yǎng)液應(yīng)來自于健康、分離效果良好的菌落，此類菌落采集自新鮮劃線的篩選平板。這一處理可確保培養(yǎng)液內(nèi)生長的細(xì)胞均出自單個基細(xì)胞(founder cell)，具有相同的遺傳組成。

小貼士：體積>10 ml的培養(yǎng)液不可直接自平板孵育，而是應(yīng)該由2–5 ml的預(yù)培養(yǎng)液稀釋1/500到1/1000而得。

質(zhì)粒規(guī)格

根據(jù)質(zhì)粒所含的，決定著控制條件嚴(yán)格還是寬松的復(fù)制原，質(zhì)粒在拷貝數(shù)方面存在很大的差異（參見下表），同時質(zhì)粒的大小和相關(guān)的插入也存在很大的差異。部分質(zhì)粒，如pUC系列和衍生物，含有可導(dǎo)致自身在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)具有極高的拷貝數(shù)的突變。基于pBR322的質(zhì)粒和很多柯斯質(zhì)粒通常能夠維持在較低的拷貝數(shù)。而體積極大的質(zhì)粒，在每個細(xì)胞內(nèi)通常都維持極低的拷貝數(shù)。

不同質(zhì)粒和科斯質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和拷貝數(shù)

* pMB1復(fù)制原與ColE1的復(fù)制原存在極其緊密的關(guān)系，具有相同的不相容群。此處所列的高拷貝數(shù)質(zhì)粒含有此復(fù)制原的突變型號。

DNA結(jié)構(gòu)	復(fù)制起點(diǎn)	拷貝數(shù)	分類
質(zhì)粒
pUC載體	pMB1*	500–700	高拷貝
pBluescript載體	ColE1	300–500	高拷貝
pGEM載體	pMB1*	300–400	高拷貝
pTZ載體	pMB1*	>1000	高拷貝
pBR322 and derivatives	pMB1*	15–20	低拷貝
pQE載體	ColE1	~30	低拷貝
pREP4	P15A	~30	低拷貝
pACYC and derivatives	P15A	10–12	低拷貝
pSC101 and derivatives	pSC101	~5	很低拷貝
科斯質(zhì)粒
SuperCos	pMB1*	10–20	低拷貝
pWE15	ColE1	10–20	低拷貝

細(xì)菌培養(yǎng)基和抗生素

液體培養(yǎng)基

大腸桿菌（E. coli）的液態(tài)培養(yǎng)液通常可在LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基中生長。但請注意，通常使用的LB培養(yǎng)基有很多種，成分也存在差異。不同的配方含有不同的NaCl濃度，可導(dǎo)致不同的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。為獲得最高的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量，我們建議使用表LB培養(yǎng)基中LB組分。

LB培養(yǎng)基

成分	每升含量
胰蛋白胨	10 g
酵母提取物	5 g
NaCl	10 g

如需配制1升LB培養(yǎng)基，需向950 ml蒸餾水或去離子水中添加10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨以及5 g酵母粉，然后振蕩、攪拌至完全溶解。用5 M NaOH將pH調(diào)整至7.0。用蒸餾水或去離子水調(diào)配溶液體積至1升。等分成小份并高壓滅菌。

小貼士：為避免整個批次集體受到污染，建議在多個小瓶內(nèi)對液態(tài)培養(yǎng)基滅菌，不要在較大的容器內(nèi)集中滅菌。高壓滅菌后，請勿在24小時內(nèi)使用培養(yǎng)基，以確保其已正確滅菌，不含污染微生物。

小貼士：從已經(jīng)過過濾除菌、等分成小份并在–20°C黑暗條件下儲存的抗生素原液中取出的抗生素，應(yīng)在使用前立即加入到液態(tài)培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)基滅菌

依照培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基瓶子尺寸和高壓滅菌類型適宜的壓力和滅菌時間，對液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基滅菌。

小貼士：為避免培養(yǎng)基在高溫下沸騰，在高壓滅菌前，應(yīng)在瓶子中注入3/4體積的培養(yǎng)基，同時保持瓶蓋松動。一旦培養(yǎng)基冷卻（降至40°C以下），立即擰緊瓶蓋，讓其徹底滅菌。

小貼士：抗生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)將在高壓滅菌器的高溫下滅活。它們應(yīng)通過孔隙為0.2 μm的過濾裝置過濾滅菌，之后再添加到從妥善儲存的原液中取出后的已冷卻、高壓滅菌的培養(yǎng)基中。

固體培養(yǎng)基

E. coli 通常在含有1.5%瓊脂糖和適當(dāng)抗生素的LB平板上劃線和儲存。

制備：依照液態(tài)培養(yǎng)基部分給定的組分配制LB培養(yǎng)基。在臨高壓滅菌前，每升中加入15 g瓊脂糖并攪拌混合。高壓滅菌之后，輕輕地渦旋培養(yǎng)基，以便將融化的瓊脂糖均勻地分散到溶液中。應(yīng)特別小心高溫液體在渦旋時出現(xiàn)沸騰。

小貼士：將高壓滅菌的瓊脂糖培養(yǎng)基冷卻到50°C以下（手握時感到溫度適宜），然后再添加對溫度敏感的抗生素和營養(yǎng)物質(zhì)。在傾倒前徹底混合，以使整個培養(yǎng)基具有均勻的濃度。

小貼士：在層流罩內(nèi)傾倒平板，如果無層流罩，則可在臨近本生燈的清潔試驗(yàn)臺面上進(jìn)行傾倒。每個標(biāo)準(zhǔn)90 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿中使用30–35 ml培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基大約對應(yīng)于30個平板）。

傾倒過平板后，通過使用本生燈火焰在表面快速略過，去除氣泡。切勿讓火焰在某處逗留，否則可能造成平板切片內(nèi)的抗生素遭破壞。

在凝固之后或者臨使用之前，取下帽蓋并將平板立在層流罩內(nèi)1小時，直接干燥平板。此外，如果您手上沒有層流罩，則可輕微開啟平板蓋，于37°C下在培養(yǎng)箱中干燥平板30分鐘，或蓋上蓋子在室溫下倒置放置2–3天。

小貼士：為保持對光線明暗的抗生素的活性，可將平板倒置，在4°C黑暗條件下儲存，或者將平板卷在鋁箔紙中。存儲時間請勿超過3個月，因?yàn)檫@會造成抗生素降解。

抗生素

對于具有抗生素篩選標(biāo)記的質(zhì)粒或基因，攜帶這些質(zhì)粒或基因的細(xì)菌株系應(yīng)在含有篩選劑的液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。缺少抗生素篩選劑，會造成帶有遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒丟失，并可能篩選出快速生長的突變！

小貼士：通過經(jīng)過過濾滅菌的各批次液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基分別制備抗生素原液，均分并在–20°C黑暗條件下儲存。常用抗生素建議的儲存和工作濃度如下表所示。

小貼士：在剛剛高壓滅菌的培養(yǎng)基中添加抗生素之前，請確保培養(yǎng)基已冷卻到50°C以下。

常用抗生素的濃度

抗生素	儲存溶液濃度	儲存溫度	工作溶液濃度（稀釋）
Ampicillin (sodium salt)	水中50 mg/ml	–20°C	100 μg/ml (1/500)
Chloramphenicol	乙醇中30 mg/ml	–20°C	170 μg/ml (1/200)
Kanamycin	水中10 mg/ml	–20°C	50 μg/ml (1/200)
Streptomycin	水中50 mg/ml	–20°C	50 μg/ml (1/200)
Tetracycline HCl	乙醇中5 mg/ml	–20°C	50 μg/ml (1/100)

裂解細(xì)菌細(xì)胞以進(jìn)行質(zhì)粒純化

由于DNA產(chǎn)量和質(zhì)量取決于用于純化的細(xì)胞裂解產(chǎn)物質(zhì)量，在質(zhì)粒分離過程中，高效裂解細(xì)菌細(xì)胞是非常重要的一個步驟。

堿裂解

堿裂解是質(zhì)粒純化之前(4, 5)最常用的細(xì)菌細(xì)胞裂解方法。堿裂解過程涉及四個基本步驟。

1. 在含有RNase A酶的Tris?Cl–EDTA緩沖液中重懸采集的細(xì)菌細(xì)胞。 
   小貼士：為確保有最大數(shù)量的細(xì)胞暴露在裂解試劑下，請確保重懸充分，無細(xì)胞抱團(tuán)。 
   小貼士：如需大規(guī)模純化低拷貝數(shù)質(zhì)粒（需要使用較大體積的培養(yǎng)液），則為了提高堿裂解效率進(jìn)而提升DNA產(chǎn)量，適當(dāng)增大裂解液的體積較為有益。
2. 使用NaOH/SDS裂解細(xì)胞。十二烷基硫酸鈉(SDS)可使細(xì)胞膜的磷脂和蛋白質(zhì)成分溶解，從而使細(xì)胞成分裂解并釋放。NaOH可以滅活染色體和質(zhì)粒DNA，以及蛋白質(zhì)。RNase A酶的存在，則可確保裂解過程中，解離的胞內(nèi)RNA能夠得以消化。 
   小貼士：如果在添加了裂解液(NaOH/SDS)之后，溶液變得非常粘稠、難以攪拌，則表示溶解步驟中存在過多的生物量。這會造成細(xì)胞裂解不充分，建議將所用的裂解液和中和液量加倍。 
   小貼士：注意避免劇烈地?cái)噭踊驕u旋振蕩裂解液，因?yàn)檫@會對細(xì)菌染色體造成剪切作用，進(jìn)而與質(zhì)粒DNA共純化。應(yīng)輕輕地，而非將裂解試管倒置的方式攪動溶液，反復(fù)4–6次。 
   小貼士：請勿讓裂解液處理的時間超過5分鐘。這樣做既能確保質(zhì)粒DNA得到最好的釋放，同時又能避免不可逆的質(zhì)粒降解。
3. 通過添加醋酸鉀中和裂解液。注：高鹽度會造成十二烷基硫酸鉀(KDS)沉淀，且變性的蛋白質(zhì)、染色體DNA和細(xì)胞細(xì)胞碎片共沉淀在不溶的鹽洗滌劑復(fù)合物中。質(zhì)粒DNA（環(huán)狀和共價閉合形式）正確復(fù)性，并保留在溶液中。 
   小貼士：通過使用冷凍的中和液和在冰上孵育，可增強(qiáng)沉淀效果。
4. 通過離心或過濾方法，清洗裂解產(chǎn)物，沉淀出殘?jiān)?nbsp;
   注：傳統(tǒng)的做法是，來自于清洗后的細(xì)菌裂解液的質(zhì)粒DNA的純化，采用氯化銫(CsCl)超純法進(jìn)行純化。目前，市面上銷售有大量的商業(yè)質(zhì)粒純化試劑盒，可藉此完成各種通量要求和應(yīng)用需要的純化操作。

其它裂解方法

我們介紹了大量細(xì)菌細(xì)胞裂解的其它方法(1, 6)。其中的部分方法是針對其他應(yīng)用開發(fā)的，并不適用于質(zhì)粒DNA制備。

• 煮沸裂解法：細(xì)菌細(xì)胞采用溶酶體來處理，以弱化細(xì)胞壁，然后通過在沸水中水浴約1分鐘加熱裂解細(xì)胞。
• 去污劑裂解：細(xì)菌細(xì)胞通過離子去污劑（例如，SDS）或非離子去污劑（例如，Triton X-100）處理的方式進(jìn)行裂解。
• 機(jī)械裂解：細(xì)菌細(xì)胞通過機(jī)械式破碎作用裂解（例如，通過超聲波處理）。 
• 酶促消化：有些裂解方法包括了采用酶（用于幫助弱化細(xì)胞壁）進(jìn)行的細(xì)菌處理步驟。 

大腸桿菌（E. coli）之外的細(xì)菌的裂解

從大腸桿菌（E. coli）之外的細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA時，為優(yōu)化特定種屬的裂解條件，通常需要修改裂解步驟。

DNA的轉(zhuǎn)化

制備感受態(tài)E. coli

具有（從各類來源）回收DNA能力的細(xì)胞被稱為“感受態(tài)”細(xì)胞。現(xiàn)有多項(xiàng)技術(shù)可制備感受態(tài)細(xì)胞，其中的的一項(xiàng)制備感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)的技術(shù)如下。

注：采用這一實(shí)驗(yàn)方案制備的細(xì)胞不宜用作電穿孔實(shí)驗(yàn)。

所需材料

• 儲存在甘油原液瓶中的E. coli
• LB培養(yǎng)基
• LB瓊脂糖平板
• 適當(dāng)?shù)暮Y選抗生素
• TFB1緩沖液（參見表Buffer TFB1）
• TFB2緩沖液（參見表Buffer TFB2）

Buffer TFB1

pH值調(diào)節(jié)至5.5，過濾滅菌。
 

工作溶液 pH 5.8	成分	每升的量
100 mM RbCl	RbCl	12.1 g
50 mM MnCl2	MnCl2·4H2O	9.9 g
30 mM potassium acetate	Potassium acetate	2.9 g
10 mM CaCl2	CaCl2	1.1 g
15% glycerol	Glycerol	15 ml

Buffer TFB2

pH值調(diào)節(jié)至6.5，過濾滅菌。

工作溶液 pH 6.8	成分	每升的量
100 mM MOPS	MOPS	2.1 g
50 mM RbCl	RbCl	1.2 g
75 mM CaCl2	CaCl2	8.3 g
15% glycerol	Glycerol	15 ml

1. 通過一根滅菌的牙簽或接種環(huán)從甘油原液瓶中取出痕量的大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞，將其接種到含有適當(dāng)濃度的相關(guān)篩選抗生素的LB瓊脂糖平板上。如果宿主株系已經(jīng)過培養(yǎng)并儲存在2–8°C下（在保證活性和存活力無大幅下降的前提下，培養(yǎng)物最多2–8°C條件下儲存3個月），則請從此類原液中挑出細(xì)菌。
2. 在37°C下孵育過夜。
3. 取一種菌落，接種到含有相關(guān)抗生素的10 ml LB培養(yǎng)基中。在37°C下生長過夜。
4. 將1 ml過夜的培養(yǎng)物添加到100 ml含有相關(guān)抗生素的預(yù)熱LB培養(yǎng)基中，然后放入500 ml搖瓶中，在37°C條件下振蕩，直至OD₆₀₀達(dá)到0.5（約需要90–120分鐘）。
5. 在冰上冷卻培養(yǎng)物5分鐘，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無菌、圓底的離心管中。
6. 低速離心收集細(xì)胞（時長5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。
7. 小心地吸棄上清液。將細(xì)胞一直置于冰上。
8. 在冰冷的(4°C) TFB1緩沖液（30 ml，適于100 ml培養(yǎng)物）中輕輕地重懸細(xì)胞，然后將懸液在冰上再置于冰上90分鐘。
9. 離心收集細(xì)胞（時長5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。 
10. 小心地吸棄上清液。將細(xì)胞一直置于冰上。
11. 在4 ml冰冷的TFB2緩沖液中小心地重懸細(xì)胞。
12. 在無菌的微量離心管中制備成100–200 μl等份，在液氮或干冰-酒精混合液中冷凍。在–70°C下儲存感受態(tài)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli

轉(zhuǎn)化是將質(zhì)粒DNA引入細(xì)菌宿主細(xì)胞的過程。有多種方法可供轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞，其中的一種方法如下。

• 感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞 
• SOC培養(yǎng)基
• LB瓊脂糖平板

SOC培養(yǎng)基

未通過高壓滅菌消毒，溶液通過0.2 μm過濾。

成分	每升的含量
胰蛋白胨	20 g
酵母提取物	5 g
NaCl	0.5 g
Dissolve, then add:
250 mM KCl	10 ml
2 M MgCl2	5 ml
Autoclave, cool, then add:
1 M sterile glucose	20 ml

1. 將一份準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的等份DNA（10 μl或更少）轉(zhuǎn)移到冰冷、滅菌的1.5 ml微量離心管中，將其置于冰上。
2. 解凍放在冰上的一等份冰凍的感受態(tài)大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞。 
3. 輕輕地重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移100 μl細(xì)胞懸液到含有質(zhì)粒DNA的微量離心管中，小心地混合，然后置于冰上約20分鐘。
4. 將離心管移到42°C水浴或恒溫槽中放置90秒。 
5. 向細(xì)胞中添加500 μl SOC培養(yǎng)基，在37°C下孵育60–90分鐘。 
   小貼士：振蕩可提升轉(zhuǎn)化效率。
6. 在含有相關(guān)抗生素的LB瓊脂糖平板中鋪盤成50、100和200 μl等份。在37°C下過夜孵育平板，直至菌落生長成型。 

陽性對照檢查轉(zhuǎn)化效率

采用1 ng含有抗抗生素基因的參比基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。鋪盤到含有相關(guān)抗生素的LB瓊脂糖平板上。比較采用對照質(zhì)粒獲得的菌落數(shù)量和采用感興趣的質(zhì)粒獲得的菌落數(shù)量，進(jìn)而比較轉(zhuǎn)化效率。

陰性對照檢查抗生素活性

在含有相關(guān)抗生素的單個LB瓊脂糖平板中鋪盤至少200 μl的轉(zhuǎn)化混合物。平板上沒有菌落則表示抗生素具有活性。

異丙醇沉淀DNA

乙醇沉淀法是常用的核酸濃縮、脫鹽和恢復(fù)方法。沉淀由高濃度的鹽和附加的異丙醇或乙醇成分介導(dǎo)。異丙醇沉淀法所需的乙醇量較少，因而成為了大批量DNA沉淀的首先方法。此外，異丙醇沉淀法可在室溫下進(jìn)行，可最大限度減少感染下游應(yīng)用的鹽共沉淀現(xiàn)象。

1. 采用醋酸鈉（0.3 M，pH 5.2，終濃度）或醋酸銨（2.0–2.5 M，終濃度）等，視必要調(diào)節(jié)鹽濃度。
2. 向DNA溶液中添加0.6–0.7體積的室溫異丙醇，然后充分混合。
   小貼士：請?jiān)谑覝叵率褂盟腥芤海员阕畲笙薅葴p少鹽共沉淀現(xiàn)象。 
   小貼士：請勿使用聚碳酸酯試管進(jìn)行沉淀，因?yàn)榫厶妓狨o耐異丙醇腐蝕能力。
3. 立即在4°C下以10,000–15,000 x g的速度離心樣本15–30分鐘。 
   小貼士：應(yīng)在4°C下離心，以防止樣本過熱。（小量沉淀時，可在室溫下離心。） 
   小貼士：也可在添加異丙醇后，使用玻璃棒，通過DNA螺旋化沉淀基因組DNA。螺旋化的DNA應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)?shù)木彌_液微量離心管中，然后再溶解（參見步驟9）。 
4. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
   小貼士：在離心之前在試管外側(cè)做出標(biāo)記，可更輕松地確定不同的沉淀。異丙醇沉淀法的沉淀具有玻璃光澤外觀，相對于通過乙醇沉淀法獲得的蓬松的含鹽沉淀，更難以看到。
   小貼士：去除上清液時需小心處理，這是因?yàn)楫惐汲恋矸ǐ@得的沉淀會更疏松地粘附在試管一側(cè)。 
   小貼士：使沉淀處于上方，小心地傾倒試管，以免沉淀移動。
   小貼士：對于較為珍貴的樣本，可保留上清液，直至已驗(yàn)證過沉淀DNA的恢復(fù)。 
5. 添加1–10 ml（具體取決于制備規(guī)格）室溫的70%乙醇，洗滌DNA沉淀。此步驟可去除共沉淀鹽，并用更具揮發(fā)性的乙醇代替異丙醇，讓DNA更易溶解。 
6. 在4°C下，以10,000–15,000 x g的速度下離心5–15分鐘。 
   小貼士：按照與之前的處理相同的方向離心試管，以便將DNA回收成緊湊的沉淀小球。
7. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
8. 風(fēng)干沉淀5–20分鐘（具體取決于沉淀的尺寸）。 
   小貼士：請勿過度風(fēng)干沉淀（例如使用真空蒸發(fā)器），因?yàn)檫@會造成DNA，尤其是高分子DNA難以溶解。
9. 在適宜的緩沖液中重新溶解DNA。  
   小貼士：根據(jù)預(yù)期的DNA產(chǎn)量和所需的最終DNA濃度，選擇適當(dāng)體積的緩沖液。  
   小貼士：請使用pH為7.5–8.0的緩沖液，因?yàn)镈NA不易在酸性緩沖液中溶解。（如采用水，則請核實(shí)其pH值。） 
   小貼士：請沖洗試管壁以回收全部的DNA，尤其是在使用玻璃試管時。為避免DNA剪切作用，請勿移液或渦旋。 
   小貼士：為避免出現(xiàn)剪切作用，應(yīng)非常溫和地再溶解高分子DNA（如基因組DNA），例如室溫下過夜，或者55°C下輕輕攪動溶解1–2小時。

儲存DNA

純化的DNA應(yīng)在–20°C或–70°C下，在弱堿性環(huán)境（例如，pH 8.0的Tris?Cl或者TE緩沖液；參見表 1 mM Tris·Cl和TE緩沖液），因?yàn)樗嵝詶l件可造成DNA水解。請勿反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會造成DNA沉淀。

稀釋后的核酸溶液（例如，用作標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋系列）應(yīng)分成等份儲存（如有可能，請儲存在硅膠管中），并僅融解一次。這種處理可避免核酸吸附在試管壁上，從而造成溶液中的核酸濃度下降。

1 mM Tris·Cl

用HCl調(diào)節(jié)pH值。

成分	每升的量
Tris base	121.1 g

TE緩沖液

成分	每升的量
1 M Tris·Cl, pH 7.4	10 ml
0.5 M EDTA, pH 8.0	2 ml

內(nèi)毒素及其注意事項(xiàng)

何為內(nèi)毒素？

內(nèi)毒素又名lipopolysaccharides或LPS，是革蘭氏陰性細(xì)菌（例如，大腸桿菌(E. coli)）的細(xì)胞膜成分。細(xì)胞膜外膜的外層脂質(zhì)部分全部由內(nèi)毒素分子組成。一個大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞約含有2百萬個LPS分子，而每個LPS分子又包含一個疏水脂質(zhì)A部分、一個糖殘基復(fù)合物陣列，以及一個帶負(fù)電的磷酸鹽基團(tuán)。因此，每個內(nèi)毒素分子處理疏水、親水和帶電的區(qū)域，使其具備了與其他分子相互作用的獨(dú)特功能。細(xì)菌積極生長過程中會向周圍的環(huán)境排出少量的內(nèi)毒素，而在其死亡時則會一次性釋放大量內(nèi)毒素。為制備質(zhì)粒而裂解細(xì)菌細(xì)胞時，內(nèi)毒素分子從細(xì)胞外膜釋放到裂解液中。

內(nèi)毒素能夠大幅降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率。此外，在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，內(nèi)毒素還會和DNA競爭“游離”的轉(zhuǎn)染試劑，影響質(zhì)粒DNA的回收。總而言之，內(nèi)毒素代表了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的一種不可控變量。它們在瓊脂糖凝膠中不可見，無法通過光密度法檢測出來，且會影響試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)果的可重現(xiàn)性，使您難以對結(jié)果進(jìn)行比對和解釋。

不同質(zhì)粒制備方法的內(nèi)毒素污染

內(nèi)毒素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及其易于形成膠束的趨向，都使其可以與質(zhì)粒DNA共純化。例如，在CsCl超速離心法中，CsCl分帶的DNA易受內(nèi)毒素分子污染，在CsCl中，內(nèi)毒素分子具有與質(zhì)粒-溴化乙錠復(fù)合物類似的密度。

在尺寸排阻樹脂中，內(nèi)毒素組成的膠束尺寸較大，會使內(nèi)毒素分子的行為表現(xiàn)類似于DNA大分子，在陰離子交換色譜柱中，內(nèi)毒素上存在的負(fù)電荷可與陰離子交換樹脂相互作用，導(dǎo)致內(nèi)毒素和質(zhì)粒DNA共純化。

即便如此，質(zhì)粒DNA中存在的內(nèi)毒素污染水平仍然依賴于所選用的純化方法。

如何測定內(nèi)毒素？

傳統(tǒng)的做法是，通過內(nèi)毒素和海鱟(Limulus polyphemus)的阿米巴樣細(xì)胞凝固蛋白之間的凝聚反應(yīng)來測定內(nèi)毒素。

如今則采用靈敏度高得多的光度測定法（例如，BioWhittaker, Inc.的Kinetic-QCL測定），該法基于鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)和合成生色底物。LPS污染程度通常以內(nèi)毒素單位(EU)來表示。通常情況下，1 ng LPS對應(yīng)于1–10 EU。

內(nèi)毒素對生物應(yīng)用的影響

內(nèi)毒素會大幅影響DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)原代細(xì)胞核敏感培養(yǎng)的細(xì)胞，較高的內(nèi)毒素水平還會顯著降低沾染效率。此外，在基因療法應(yīng)用中采用不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA也非常重要，這是因?yàn)閮?nèi)毒素會引起動物和人發(fā)燒、內(nèi)毒素休克綜合征、以及補(bǔ)體級聯(lián)激活等臨床癥狀。

內(nèi)毒素還會通過免疫反應(yīng)非特異性激活，干擾體外轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動物細(xì)胞（例如巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞）。此類反應(yīng)包括免疫介導(dǎo)物（例如，IL-1和前列腺素）的誘導(dǎo)合成。為避免誤讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確保塑料器皿、培養(yǎng)基、血清和質(zhì)粒DNA不含LPS污染物非常重要。

不含內(nèi)毒素的塑料和玻璃器皿

為避免在初次內(nèi)毒素去除之后質(zhì)粒DNA被二度污染，建議僅使用經(jīng)認(rèn)證不含致熱源、不含內(nèi)毒素的新塑料制品。不含內(nèi)毒素、不含致熱源的塑料制品可自很多供應(yīng)商處購買。

內(nèi)毒素對玻璃制品具有較強(qiáng)的吸附性，在洗滌時難以徹底清除。標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室高壓滅菌操作對內(nèi)毒素水平無影響或者影響很小。此外，如果之前已采用高壓滅菌設(shè)備處理過細(xì)菌，玻璃制品會受到內(nèi)毒素分子過渡污染。為徹底殺滅粘附的內(nèi)毒素分子，建議在180°C下過夜加熱玻璃制品。

此外，使用不含內(nèi)毒素的試劑，避免純化的不含內(nèi)毒素DNA不受二度污染非常重要。

定量DNA

對于很多分子生物學(xué)應(yīng)用，可靠測定DNA濃度非常重要。分光光度測定法和熒光測定法是常用的基因組和質(zhì)粒DNA濃度測定方法。分光光度測定法可用于測定微克量級的純DNA樣本（即，不受蛋白質(zhì)、苯酚、瓊脂糖或RNA污染的DNA）。熒光測定法更敏感，可測定納克量級的DNA，此外使用Hoechst 33258染料可以對DNA進(jìn)行特異性分析。

分光光度測定法

可通過在石英分光比色液槽中，用分光光度計(jì)測定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來測定DNA濃度。為確保最高的精度，讀數(shù)應(yīng)處于0.1和1.0之間。260 nm處1單位的吸光度，對應(yīng)于每ml內(nèi)50 μg基因組DNA（A₂₆₀ =1對應(yīng)于50 μg/ml；基于標(biāo)準(zhǔn)的1 cm通道長度。這一關(guān)系僅在中性PH下測定時有效，因此樣品應(yīng)采用中性PH的低鹽緩沖液（例如，pH 7.0的Tris?Cl）稀釋。

處理少量DNA時，諸如使用純化后的PCR產(chǎn)物或提取自瓊脂糖凝膠的DNA片段，通過瓊脂糖凝膠分析定量將更有效。

小貼士：如果您使用多個比色皿測定多個樣本，所用的各個比色皿必須相匹配。

小貼士：分光光度法測定并不區(qū)分DNA和RNA，因此RNA污染物會造成估算出的DNA濃度虛高。

小貼士：苯酚具有最高270–275 nm的吸光范圍，與DNA的吸光范圍比較接近。苯酚污染物會造成虛假的高產(chǎn)量和高純度，這是因?yàn)?em>A₂₆₀值出現(xiàn)上調(diào)。

溶劑對分光光度計(jì)讀數(shù)的影響

核酸的吸光度取決于溶解核酸所用的溶劑(7)。使用低鹽度緩沖液時，A₂₆₀數(shù)值可重現(xiàn)，但如果使用水，則不可實(shí)現(xiàn)。由于空氣中CO2溶解而引起的水PH值變化時，很可能出現(xiàn)這種情況。在水中測定的A₂₆₀/A₂₈₀比率也會引起讀數(shù)（參見溶劑對A₂₆₀/A₂₈₀比率的影響）出現(xiàn)較大波動，通常獲得的比率<1.8，這會造成對蛋白污染物的敏感度下降(7)。相反，在低鹽、弱堿性PH值的緩沖液下測得的A₂₆₀/A₂₈₀比率通常是可重現(xiàn)的。

RNA污染對分光光度讀數(shù)的影響

根據(jù)所使用的DNA分離方法，RNA將與基因組DNA共同純化。RNA可能會抑制一些下游的應(yīng)用，但它不會抑制PCR。分光光度法測量不能分辨DNA和RNA，所以RNA的污染可導(dǎo)致DNA濃度被高估。雖然不能被有效地定量檢測，RNA污染有時仍可以通過瓊脂糖凝膠電泳分析配合常規(guī)溴化乙錠染色進(jìn)行檢測。RNA條帶出現(xiàn)模糊和污染，并且只在≥25-30 ng可以被檢測到（RNA：DNA的比例為0.5:1 ）。

RNase A處理將去除被污染的RNA，這可以合并到純化步驟中或在DNA被純化后進(jìn)行。在使用之前，為了破壞任何可能存在的DNase活性污染，請確保RNase A的溶液已經(jīng)被熱處理過。或者，使用從一個可靠的供應(yīng)商處購買的去DNase的RNase。

質(zhì)粒DNA的RNA污染取決于質(zhì)粒的制備方法。使用堿裂解與苯酚抽提的方法不能從質(zhì)粒DNA中分離出RNA，從而導(dǎo)致高水平的RNA污染。先進(jìn)的陰離子交換技術(shù)可以分離高分子量的不含RNA的基因組DNA。

DNA的純度

在260 nm和280 nm處的讀數(shù)比值（A₂₆₀/A₂₈₀）提供了相對于吸收紫外光污染物（如蛋白質(zhì)）的DNA純度估計(jì)值。A₂₆₀/A₂₈₀比值受pH值影響顯著。由于沒有緩沖作用，pH值和由此產(chǎn)生的A₂₆₀/A₂₈₀比值可以變化很大。較低的pH值會導(dǎo)致較低的A₂₆₀/A₂₈₀比值，同時降低對蛋白質(zhì)污染的敏感性（7）。為獲得精確的A₂₆₀/A₂₈₀值，我們建議在微堿性緩沖液中測量吸光度（如10 mM Tris?Cl, pH 7.5）。一定要使用適當(dāng)?shù)木彌_液對分光光度計(jì)較零。

純DNA A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.7–1.9。在220–320 nm之間掃描吸光度，將顯示在260 nm處是否有污染物影響吸光度。吸光度掃描曲線應(yīng)該在260 nm出現(xiàn)峰值并且整體平滑。

熒光分析法

熒光分析法通過使用熒光染料可以對DNA濃度進(jìn)行特異性、靈敏的測定，其可采用包括Hoechst染料和PicoGreen在內(nèi)的常見染料。

Hoechst3258對RNA的親和力較小，可以精確定量被RNA污染的DNA樣品。這表明與DNA結(jié)合后在458 nm熒光值增加。DNA標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與Hoechst33258混合，使用掃描型熒光分光光度計(jì)或?qū)Ｓ脼V波器熒光計(jì)在365 nm激發(fā)波長和460 nm發(fā)射波長在玻璃或丙烯酸比色皿中測定。樣品測量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，以確定DNA濃度。

小貼士：因?yàn)镠oechst33258優(yōu)先與AT富集的DNA結(jié)合，請使用與DNA樣品具有類似堿基組成的標(biāo)準(zhǔn)品。

PicoGreen測定法對dsDNA高度敏感，可以在200 μl體積中測量低至20 pg的dsDNA。其實(shí)，從500 pg/ml到500 ng/ml濃度的DNA都可以使用單一濃度的染料測定。該測定已經(jīng)過優(yōu)化，可最大限度減少RNA和ssDNA的熒光值，使得dsDNA可以在等摩爾濃度的ssDNA和RNA存在的情況下精確定量，并最大限度減少二者定量結(jié)果的影響。

瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠電泳分析能夠快速而簡單地定量檢測DNA，特別是小DNA片段（如PCR產(chǎn)物）。少至20 ng的DNA都可通過瓊脂糖凝膠電泳配合溴化乙錠染色進(jìn)行檢測。在瓊脂糖凝膠上，DNA樣品是在已知量的相同或類似大小DNA的旁邊進(jìn)行電泳。加樣的樣品DNA的量可通過可視化或成像系統(tǒng)掃描其條帶強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品的對比來估計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)品的片段大小請務(wù)必與目的基因大致相同，以確保DNA含量評估的可靠性，因?yàn)檩^大片段比小片段更易螯合染料，形成更強(qiáng)的條帶強(qiáng)度。

更精確的瓊脂糖凝膠定量可以通過密度計(jì)分辨條帶強(qiáng)度，并與使用已知濃度的DNA所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中的有效密度定量范圍在20–100 ng之間。

小貼士：用于密度定量的DNA量應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

有關(guān)瓊脂糖凝膠電泳更多的信息請見使用凝膠分析DNA 。

DNA的限制性內(nèi)切酶消化

限制性內(nèi)切酶消化原理

許多應(yīng)用都需要使用限制性內(nèi)切酶將gDNA轉(zhuǎn)換為大小適宜的片段。這一處理可獲得大小適宜、利于下游操作的DNA片段。限制性內(nèi)切酶是一種可以在特異性靶序列內(nèi)結(jié)合和剪切DNA的細(xì)菌酶。II型限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中最廣泛使用的工具。它們在特異性識別位點(diǎn)結(jié)合DNA，其中包括一個短回文序列，并且在該位點(diǎn)內(nèi)裂解，例如，AGCT（用于AluI）中，GAATTC（ 用于EcoRI）等。同裂酶是一種不同的酶，他們具有相同的特異性，并在某些情況下還具有相同的剪切類型。

小貼士：同裂酶屬性可能略有不同，這點(diǎn)非常有用。例如，MboI和Sau3A酶具有相同的序列特異性，但MboI不剪切甲基化DNA，而Sau3A可以。因此，在需要的時候，Sau3A可以用來代替MboI。

選擇合適的限制性內(nèi)切酶

選擇合適的限制性內(nèi)切酶時需要考慮以下幾個因素：

• 片段大小
• 甲基化敏感性
• 平端/粘性末端片段
• 反應(yīng)條件的相容性（使用一個以上的酶時）

片段大小

限制性內(nèi)切酶具有較短的識別序列并且比那些具有較長識別序列的酶剪切的更為頻繁。例如，一個4堿基對（bp）的剪切酶平均剪切4⁴（256）個堿基，而一個6 bp的剪切酶平均剪切4⁶（4096）個堿基。

小貼士：定位基因組DNA或YAC、BAC或者P1可使用6 bp剪切酶，因?yàn)檫@些酶剪切片段的大小范圍適合于克隆。

甲基化

許多有機(jī)體具有一種被稱為甲基化酶的酶，可以在特定序列將DNA甲基化。當(dāng)位點(diǎn)被甲基化后，不是所有的限制性內(nèi)切酶都能剪切其識別的位點(diǎn)。因此，限制性內(nèi)切酶的選擇受其對甲基化敏感性的影響。此外，甲基化模式在不同的物種間具有差異，這也影響到限制性內(nèi)切酶的選擇。

• 與概率預(yù)期相比，CpG二核苷酸在哺乳動物DNA中發(fā)生甲基化大約減少5倍量，如果胞嘧啶被甲基化，則大多數(shù)限制性內(nèi)切酶在CpG二核苷酸識別位點(diǎn)無法剪切。因此，許多酶在CpG的識別位點(diǎn)，如 EagI、NotI和SalI很少剪切哺乳動物DNA。
• 果蠅、線蟲和其它一些物種不具有甲基化的DNA，并其CpG二核苷酸的含量比例高于哺乳動物。因此Rare剪切酶在這些物種中的剪切更加頻繁。
• 植物的DNA是高度甲基化的，所以為了在植物中成功定位，所選擇的酶要么在其識別位點(diǎn)不含有CpG二核苷酸（例如DraI或SspI），要么可以剪切甲基化的CpG二核苷酸（例如，BamHI、KpnI或者TaqI）。

小貼士：細(xì)菌和真核生物之間的甲基化類型不同，所以克隆和非克隆DNA的限制帶型可能會有所不同。

小貼士：不同真核生物之間的甲基化類型也不同（見以上圖表），并影響構(gòu)建基因組DNA文庫的限制性內(nèi)切酶的選擇。

平端/粘性末端片段

有些限制性內(nèi)切酶剪切識別位點(diǎn)的中段，產(chǎn)生平端的DNA片段。然而，大多數(shù)酶的剪切交錯在每條鏈上，導(dǎo)致在每個片段的末端出現(xiàn)含有數(shù)個堿基對的單鏈DNA，被稱為“粘性”末端。有些酶剪切出5'突出端而其他一些則剪切出3'突出端。剪切的類型會影響下游克隆的難易：

• 粘性末端片段可以輕易連接到具有單鏈突出端的其他片段的粘性末端，從而產(chǎn)生高效的克隆。
• 平末端片段的連接效率通常要少得多，使得其克隆更加困難。然而，任何平端片段可以與任何其他的平端相連接，所以當(dāng)不能生成親和的粘性末端片段時，就要使用平端剪切酶，例如，如果載體的多接頭位點(diǎn)不含有被克隆片段的酶親和位點(diǎn)。

反應(yīng)條件的相容性

如果使用一種以上的酶對DNA片段進(jìn)行剪切，這兩種酶可以同時添加到反應(yīng)中，前提是它們在相同的緩沖液中活性相同并可在同一溫度下進(jìn)行反應(yīng)。如果酶不具有親和的反應(yīng)條件，有必要對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行剪切、純化，然后進(jìn)行第二次剪切。

限制性剪切成分

• 水
• DNA
• 緩沖液
• 酶

剪切的DNA量依賴于下游應(yīng)用和被分析生物的基因組大小。我們建議哺乳動物和植物基因組DNA蛋白印跡法每次反應(yīng)使用至少10 μg的DNA。為了定位克隆DNA，每個反應(yīng)0.2–1 μg DNA足夠。

小貼士： DNA應(yīng)無苯酚、氯仿、乙醇，洗滌劑或鹽等污染，因?yàn)檫@些污染物可能對限制性內(nèi)切酶活性造成干擾。

一單位的限制性內(nèi)切酶在1小時內(nèi)可以完全剪切1 μg底物DNA。然而，超螺旋質(zhì)粒DNA通常需要超過1個單位/μg的酶才能被完全剪切。為了確保完全剪切，大多數(shù)研究人員加入10倍過量的限制酶確保完全反應(yīng)。

小貼士：請確保限制性內(nèi)切酶不超過總反應(yīng)體積的10％，否則承載酶的甘油可能會抑制剪切。

反應(yīng)體積

大多數(shù)剪切是在10–50 μl的體積中進(jìn)行。（反應(yīng)體積小于10 μl易受移液誤差影響，不推薦使用。）

限制性酶切準(zhǔn)備

1. 將反應(yīng)組分移液到皮氏管中并用移液槍拌勻。
   小貼士：徹底混合非常重要。
   小貼士：酶應(yīng)保持在冰上并在最后添加。 
   小貼士：當(dāng)準(zhǔn)備大量的剪切反應(yīng)，用緩沖液和酶配制反應(yīng)預(yù)混液，并等分到含有被剪切DNA的皮氏管中。
2. 短暫離心后收集底部的液體。
3. 使用水浴或加熱模塊在37℃孵育剪切反應(yīng)，通常需要1-4小時。然而一些限制性內(nèi)切酶需要更高的孵育溫度（如50–65℃），而其他則要求較低的（如25℃）孵育溫度。
4. 對于一些下游應(yīng)用，有必要在剪切反應(yīng)后熱滅活酶。剪切反應(yīng)后加熱至65℃保持20分鐘，滅活大多數(shù)最佳孵育溫度為37℃的酶。注意，某些限制性內(nèi)切酶并不能完全被熱處理滅活。

DNA的連接

為了構(gòu)建新的DNA分子，DNA必須先使用限制性內(nèi)切酶剪切（參見 DNA的限制性內(nèi)切酶剪切）。所需DNA分子的各個組分被純化，然后合并，用DNA連接酶處理。連接混合物被導(dǎo)入到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化效果通過適當(dāng)?shù)倪z傳選擇鑒別。同時也應(yīng)適當(dāng)?shù)倪B接對照反應(yīng)進(jìn)行

從線性化載體DNA去除 5'磷酸可以幫助防止載體的自身連接，提高連接效率。從DNA除去5'磷酸，添加小牛腸磷酸（CIP）緩沖液和1 U CIP在 37℃孵育30–60分鐘。一旦反應(yīng)完成后，通過加熱至75℃15分鐘滅活CIP。

1. 按照表典型連接反應(yīng)建立典型的連接反應(yīng)。
2. 2. 15℃下孵育1-24小時。
   小貼士：簡單的兩片段4 bp的3’或5’突出端連接反應(yīng)比更復(fù)雜的連接反應(yīng)或平端連接反應(yīng)所需要的酶要少得多。DNA的質(zhì)量也將影響所需連接酶的量。
   小貼士：粘性末端的連接通常是在12–15℃下進(jìn)行，目的是在末端退火和酶活性保持之間找到平衡。較高的溫度下末端退火比較苦難，而較低的溫度會降低連接酶的活性。
   小貼士：平端連接反應(yīng)通常在室溫下進(jìn)行，因?yàn)橥嘶鸩皇且粋€影響因素，但這種酶在高于30℃是不穩(wěn)定的。相比達(dá)到同等效率的粘性末端連接反應(yīng)，平端連接反應(yīng)需要大約10–100倍以上的酶。
3. 介導(dǎo)1–10 μl的連接產(chǎn)物到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，并使用存在于載體上的遺傳標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化株
4. 通過小量制備過程從單個 E. coli轉(zhuǎn)化株純化質(zhì)粒或噬菌體DNA，并通過限制酶定位確定它們的結(jié)構(gòu)。 
   小貼士：建議在每一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中加入兩個對照：一個沒有DNA的“模擬”轉(zhuǎn)化組，以及一個已知量的閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化組。

典型的連接反應(yīng)

成分	量
感受態(tài)DNAs	0.1–5 μg
連接酶緩沖液	多種
10 mM ATP	1 μl
T4 DNA連接酶	20–500 U

如果實(shí)驗(yàn)出錯，則對照組是必不可少的。例如，模擬轉(zhuǎn)化的細(xì)菌平板菌落可以顯示該培養(yǎng)基是否缺乏正確的抗生素。未構(gòu)建質(zhì)粒的細(xì)菌轉(zhuǎn)化組平板上沒有出現(xiàn)菌落只有使用標(biāo)準(zhǔn)DNA的陽性對照組才能解釋。

使用分析凝膠分析DNA

凝膠可以基于電荷遷移原理分離和鑒定核酸。核酸分子在電場中的遷移是由大小和構(gòu)象決定的，從而使得不同大小的核酸片段得以分離。然而，片段的大小和遷移率之間的關(guān)系是非線性的，因?yàn)檩^大的片段具有更大的摩擦阻力，并且在聚合物中遷移效率更低。

瓊脂糖凝膠分析是0.1至25 kb 長度DNA片段最常用的分析方法，而脈沖場凝膠電泳可分析的DNA片段達(dá)到10,000 kb。本節(jié)提供了DNA凝膠分析有益的建議。

倒瓊脂糖凝膠

瓊脂糖濃度

用于凝膠的瓊脂糖的濃度主要取決于進(jìn)行分析的DNA片段大小。低濃度瓊脂糖被用于分離大片段DNA，而高濃度的瓊脂糖可以提高小DNA片段的分辨率。雖然一些特殊類型的瓊脂糖可用于特定的應(yīng)用，但大多數(shù)凝膠使用的是標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖。例如，低熔瓊脂糖上可以進(jìn)行原位酶促反應(yīng)，因此可用于制備凝膠。基因組DNA可以直接從固定細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中分離出來。

小貼士：使用超純瓊脂糖可以避免多糖、鹽和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)對DNA遷移的影響。使用高百分比瓊脂糖凝膠瓊脂糖時，質(zhì)量就顯得尤為重要。

用于分離不同大小片段的瓊脂糖濃度

來自參考文獻(xiàn)1和6.
*雖然一些特殊類型的瓊脂糖可用于特定的應(yīng)用以及非常高或低的瓊脂糖濃度，但大多數(shù)凝膠使用的是標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖。例如，低熔瓊脂糖上可以進(jìn)行原位酶促反應(yīng)，因此可用于制備凝膠。

瓊脂糖濃度 (% w/v)	DNA片段大小范圍(kb)
0.3*	5–60
0.5	1–30
0.7	0.8–12
1.0	0.5–10
1.2	0.4–7
1.5	0.2–3
2.0*	0.1–2

電泳緩沖液

最常用的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液是TBE（Tris?borate–EDTA）和TAE（Tris?acetate–EDTA）。TAE雖然使用越來越頻繁，但與TBE相比，TAE緩沖能力較低，并且在長時間電泳過程中更容易耗盡。TBE能提供更好的分辨率和更清晰的條帶，特別推薦用于分析片段大小 <1 kb的情況。

TBE的缺點(diǎn)是，緩沖液中的硼酸鹽離子會與糖單體和聚合物的cis-diol基團(tuán)形成復(fù)合物，因此很難從使用傳統(tǒng)方法TBE凝膠中提取DNA片段。

TAE

1x工作溶液成分	每升50x儲存溶液成分	每升的量
40 mM Tris·acetate	Tris base	242 g
1 mM EDTA	冰醋酸	57.1 ml
–	0.5 M EDTA, pH 8.0	100 ml

TBE

0.5x工作溶液成分	每升5x儲存溶液成分	每升的量
40 mM Tris·borate	Tris base	54 g
1 mM EDTA	Boric acid	27.5 ml
–	0.5 M EDTA, pH 8.0	20 ml

Gel 上樣緩沖液

* 可以用15％聚蔗糖（400型），或30％的甘油代替蔗糖。

6x工作溶液成分	每10 ml 5x儲存溶液成分	每10 ml的量
0.25% bromophenol blue	Bromophenol blue	25 mg
0.25% xylene cyanol FF	Xylene cyanol FF	25 mg
40% (w/v) 蔗糖*	蔗糖	5 ml

凝膠灌注

1. 準(zhǔn)備足夠的1X電泳緩沖液，以便灌注凝膠和填滿電泳槽。
2. 添加適量瓊脂糖（取決于所需的濃度）到盛裝適量電泳緩沖液的搖瓶或小瓶中（取決于正在使用的電泳裝置的類型）。
   小貼士：盛裝容器不應(yīng)超過半滿。覆蓋容器以減少蒸發(fā)。
   小貼士：始終使用同一批緩沖制備用于凝膠的瓊脂糖，因?yàn)殡x子強(qiáng)度的微小差別會影響DNA的遷移。
3. 在微波爐或沸水浴中加熱的漿液，間或渦旋容器直到瓊脂糖溶解。
   小貼士：請確搖瓶蓋是松動的，以免積聚的壓力。小心勿讓瓊脂糖溶液因?yàn)樽兊眠^熱而沸騰。
   小貼士：如果液體的體積在加熱過程中因蒸發(fā)而大大減少，則需用蒸餾水彌補(bǔ)至原來的體積。這一處理可確保瓊脂糖的濃度是正確的，并且凝膠和電泳緩沖液具有相同的緩沖組分。
4. 將瓊脂糖冷卻至55–60℃。
5. 將瓊脂糖溶液傾倒入厚度為3–5 mm的凝膠電泳槽中。填充凝膠之前或在填充之后立刻插入梳子。讓凝膠凝固（30–40分鐘）。
   小貼士：確保梳子的底部和玻璃板（0.5–1.0 mm）之間有足夠的空間，以便形成適當(dāng)?shù)氖峥祝苊鈽悠沸孤?br /> 小貼士：請確保凝膠內(nèi)或梳孔中沒有氣泡。
6. 小心從凝膠中取出梳子和膠條（如果使用）。用電泳緩沖液填充含有凝膠的電泳槽。
   小貼士：加入足夠的緩沖液覆蓋凝膠，凝膠到液體表面的深度大約1 mm。如果使用的緩沖液太多，電流將流過緩沖液，而不是凝膠。

進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳可以分析大小在0.1到25 kb范圍內(nèi)的DNA片段（比如，用頻繁剪切的限制性核酸內(nèi)切酶消化的基因組DNA），而脈沖場凝膠電泳可以分析長達(dá)10,000 kb的DNA片段（比如，未消化的基因組DNA或者用稀有剪切的限制性核酸內(nèi)切酶消化的基因組DNA）。加載到凝膠上的基因組DNA的量取決于具體的應(yīng)用，但通常情況下，應(yīng)該避免加入太多的DNA，因?yàn)檫@會造成凝膠上DNA條帶脫尾。

在加樣之前，必須在樣品中加入凝膠加樣緩沖液，這主要是因?yàn)槿齻€目的：

• 增大樣品的密度，確保在加樣時，樣品能下沉到小孔中。
• 通過使用染料，比如溴酚藍(lán)或者二甲苯藍(lán)，使樣品帶有顏色，以便輔助加樣。
• 通過染料和特定大小的DNA片段的共遷移來追蹤電泳過程。

在進(jìn)行凝膠電泳時，一定要包含分子量標(biāo)記物，以便分析樣品中DNA片段的大小。常用標(biāo)記物的信息請參見表瓊脂糖凝膠電泳中常用的DNA標(biāo)記物。

瓊脂糖凝膠電泳中常用的DNA標(biāo)記物

l HindIII	l HindIII–EcoR1	EcoR1	f X174 HaeIII
21,130	21,226	21,226	1353
9416	5184	7421	1078
6557	4973	5804	872
4361	4268	5643	603
2322	3530	4878	310
2027	2027	3530	281
564	1904		271
125	1584		234
	1375		194
	947		118
	831		72
	564
	125

樣品的準(zhǔn)備

1. 將1體積的凝膠加樣緩沖液加入到6體積的DNA樣品中并混合。 
   在樣品加樣到凝膠上之前，一定要與凝膠加樣緩沖液混合。
   小貼士：樣品的體積，不應(yīng)接近于加樣孔的體積，因?yàn)闃悠房赡軙绯觯M(jìn)入相鄰的加樣孔。
   小貼士：確保所有樣品中的緩沖液的成分是相同的。比如，一些限制性的緩沖液，具有很高的鹽濃度，這會阻礙DNA片段的遷移。 
   確保樣品中沒有乙醇，因?yàn)橐掖紩?dǎo)致加樣時樣品流出加樣孔。

瓊脂糖凝膠電泳

1. 將凝膠加樣緩沖液中的樣品，加入到凝膠加樣孔中。
   在加樣之前，通過用電泳緩沖液洗滌，去除加樣孔中的氣泡。
   小貼士：確保整個凝膠都浸入到了電泳緩沖液中。
   小貼士：在加樣時，將移液管吸頭插入加樣孔深處，并將液體緩緩排出。
   小貼士：注意不要用移液管吸頭破壞瓊脂糖凝膠。 
   小貼士：加入樣品之后，不要移動電泳槽，因?yàn)檫@樣會使樣品流出加樣孔。 
   小貼士：至少一條泳道是合適的分子量標(biāo)記物。
2. 連接電極，這樣DNA分子會向陽極遷移（正電極）。 
   小貼士：一定要覆蓋電泳儀器，以避免受到電擊。
3. 接通電源，在1–10V/cm的條件下進(jìn)行電泳，直到染料遷移了合適的距離。這取決于所要分析的DNA大小，凝膠中瓊脂糖的濃度，以及所需要的分離程度。
   小貼士：避免使用高電壓，這會導(dǎo)致凝膠中DNA條帶的脫尾，特別是對于高分子量的DNA分子而言。
   小貼士：在進(jìn)行電泳時，周期性的監(jiān)控緩沖液的溫度。如果緩沖液的溫度很高，那么需要降低電壓。
   小貼士：如果瓊脂糖凝膠在電泳中溶解了，這說明緩沖液制備的不正確，或者緩沖液在電泳中消耗完了。
   小貼士：對于非常長時間的電泳，比如過夜的電泳，使用泵循環(huán)利用緩沖液。

脈沖場凝膠電泳

1. 將凝膠加樣緩沖液中的樣品加入到凝膠加樣孔中。
   小貼士：脈沖場凝膠電泳使用很高的電壓，因此應(yīng)該使用TBE緩沖液，它比TAE緩沖液有更強(qiáng)的緩沖能力。
   小貼士：在加入樣品之前，通過使用電泳緩沖液洗滌，趕走加樣孔中的氣泡。
   小貼士：確保整個凝膠都浸入到了電泳緩沖液中。
   小貼士：在加樣時，將移液管吸頭插入加樣孔深處，并將液體緩緩排出。注意不要用移液管吸頭破壞瓊脂糖凝膠。
   小貼士：加入樣品之后，不要移動電泳槽，因?yàn)檫@樣會使樣品流出加樣孔。
   小貼士：至少一條泳道是合適的分子量標(biāo)記物。
2. 連接電極，這樣DNA分子會向陽極遷移（正電極）。
   小貼士：一定要覆蓋電泳儀，以避免受到電擊。
3. 接通電源，在170V/cm的條件下進(jìn)行電泳，每隔5–40s改變電壓方向，直到染料遷移了合適的距離。這取決于所要分析的DNA尺寸，凝膠中瓊脂糖的濃度，以及所需要的分離程度。
   小貼士：在進(jìn)行電泳時，周期性的監(jiān)控緩沖液的溫度。如果緩沖液的溫度很高，則需要降低電壓。
   小貼士：如果瓊脂糖凝膠在電泳中溶解了，這說明緩沖液制備的不正確，或者緩沖液在電泳中消耗完了。 
   小貼士：對于非常長時間的電泳，比如過夜的電泳，請使用泵循環(huán)緩沖液。

凝膠電泳的可視化分析

染色

為了將DNA樣品可視化，需要用合適的染料將瓊脂糖凝膠染色。最常用的染料是嵌入式的熒光染料溴化乙錠，在電泳之前和之后加入都可以。此外，也可選擇其它染料，包括一些最近開始使用的市售染料，比如SYBR Green。

小貼士：溴化乙錠原液（通常為10 mg/ml）應(yīng)該儲存在4°C的環(huán)境下，儲存在深色瓶子或者被鋁箔包裹的瓶子中。

在電泳前加入溴化乙錠——將0.5 μg/ml的溴化乙淀加入到融化并冷卻的瓊脂糖中，也就是在制備凝膠之前加入。

將瓊脂糖-溴化乙錠溶液充分混勻，以避免局部染色。

在電泳之后加入溴化乙淀——將凝膠浸泡在0.5 μg/ml的溴化乙錠（在水溶液中或者在電泳緩沖液中）中30–40分鐘。

小貼士：在檢查凝膠之前，使用水或者緩沖液洗滌，以除去多余的溴化乙錠。

小貼士：染色的緩沖液可以收集起來重新使用。

注：溴化乙錠是一種效果很強(qiáng)的誘變劑，毒性很高。在操作時要戴手套，并且采取合適的安全措施。因?yàn)槿槟z手套可能不能提供完全的保護(hù)，所以要使用丁晴手套。在使用之后，應(yīng)該按照常規(guī)使用手冊里面所描述的方法對溴化乙錠溶液去污。

可視化

溴化乙錠-DNA偶聯(lián)物比溶液中的燃料熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。這意味著，使用紫外光（254–366 nm）照射瓊脂糖凝膠，可以在未結(jié)合DNA分子的染料背景上，顯示出DNA條帶。凝膠的圖像可以通過波拉一步攝影技術(shù)或者凝膠成像系統(tǒng)記錄下來。

小貼士：紫外光會傷害眼睛和皮膚。在使用紫外光源工作時，一定要佩戴合適的護(hù)目鏡和面部保護(hù)器械。

小貼士：紫外光線會損害DNA。如果需要將DNA片段從凝膠里面提取出來，盡量使用低強(qiáng)度的紫外光源，并且盡量縮短DNA暴露在紫外光源下的時間。

溴化乙錠染色方法的比較

在電泳前加入溴化乙錠	在電泳后加入溴化乙錠
處理起來更快，并且操作更為方便	處理流程較慢，并且需要額外的步驟
在電泳時可以監(jiān)控分子的遷移	在電泳時不能監(jiān)控分子的遷移
需要對電泳槽和電泳梳子進(jìn)行去污清潔	不需要對電泳槽和電泳梳子進(jìn)行去污清潔
需要較多的溴化乙淀	需要較少的溴化乙淀
線形DNA分子的電泳遷移率降低了 ~15%	不影響電泳遷移率

使用DNA印跡法（Southern印跡）分析DNA

DNA印跡法是一種廣泛使用的技術(shù)，用于分析特定的DNA序列。首先使用限制性的酶消化，將DNA分子轉(zhuǎn)變成大小易于操作的片段。然后將DNA分子加入到瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（6）。DNA印跡法（Southern印跡）（以它的發(fā)明者E.M.Southern的名字命名）指將DNA通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法，轉(zhuǎn)移到尼龍或者硝化纖維素薄膜上。靶標(biāo)DNA可以通過與放射性的或者化學(xué)發(fā)光的探針雜交來定位，并通過射線自顯影或者染色觀察到。

DNA印跡法具體的操作流程存在很多變化。這里描述了標(biāo)準(zhǔn)的方案和緩沖液以及其它溶液的配方。

所需設(shè)備

• Whatman 3MM濾紙
• 印跡薄膜
• 大約高15–20 cm的一疊紙巾
• 保鮮膜
• 兩個玻璃或者有機(jī)玻璃平板
• 可以盛放1–2升緩沖液的緩沖液平皿（比如，玻璃平皿）
• 支撐物（放置在緩沖液的平皿中）
• 平板，大約1 kg重
• 大約80°C的烤箱或者紫外透射儀
• 搖床

為Southern印跡制備凝膠

大DNA分子片段化（可選）

長度大于10 kb的DNA片段，不能有效地轉(zhuǎn)移到印跡薄膜上。為了使它們能順利轉(zhuǎn)移，需要減小這些片段的大小，這可以通過在酸環(huán)境下脫嘌呤實(shí)現(xiàn)，也可以通過紫外光照射實(shí)現(xiàn)。

酸環(huán)境下脫嘌呤——在凝膠電泳之后，立刻將凝膠完全浸沒在0.2 M的HCl溶液中。輕輕搖動10分鐘。在這個過程中，樣品中溴酚藍(lán)的顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，說明凝膠已經(jīng)完全浸透了酸溶液。使用去離子水簡單的洗滌凝膠。

小貼士：脫嘌呤步驟不應(yīng)該持續(xù)太長時間，因?yàn)樘痰钠闻c薄膜黏附的穩(wěn)定性比較差。

小貼士：脫嘌呤過的凝膠會導(dǎo)致在最后的射線自顯影中產(chǎn)生模糊的條帶，這主要是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)移時，DNA片段的擴(kuò)散性增強(qiáng)了。因此，僅在要轉(zhuǎn)移長度大于10 kb的片段的時候，推薦使用脫嘌呤。

紫外光照射——將凝膠暴露在光源功率為30 W，波長為254 nm的紫外光中30–60秒。

變性

雙鏈DNA必須變性，以便制備合適的雜交目標(biāo)。將凝膠完全浸沒在變性緩沖液中，輕輕搖晃，孵育30分鐘。如果使用酸性條件下的脫嘌呤法使DNA變性，在孵育過程中，溴酚藍(lán)將會逐漸轉(zhuǎn)變成它原來的顏色。

復(fù)性

去除變性緩沖液，將凝膠完全浸泡在復(fù)性緩沖液中。輕輕搖晃，孵育30分鐘。

變性緩沖液

工作溶液成分	成分	每升的量
1.5 M NaCl	NaCl	87.7 g
0.5 M NaOH	NaOH	20 g

復(fù)性緩沖液

緩沖液pH 7.4。使用HCl調(diào)整至pH 7.4.

工作溶液成分	成分	每升的量
1 M Tris·Cl	Tris base	121.1 g
1.5 M NaCl	NaCl	87.7 g

20x SSC

使用NaOH調(diào)整至pH 7.4 。

工作溶液成分	成分	每升的量
3 M NaCl	NaCl	175.3 g
0.3 M Sodium citrate	Sodium citrate-H2O	88.2 g

組裝用于印跡實(shí)驗(yàn)的器械

1. 將比凝膠大一些的支撐物放置在盛有10x SSC的平皿中，用玻璃或者有機(jī)玻璃平板覆蓋支撐物。
2. 剪兩條比凝膠寬的Whatman 3MM濾紙，大小要適合墊在凝膠下方，長度要能達(dá)到平皿兩端的底部。使用10x SSC潤濕濾紙，然后將它們放置在玻璃板上。用移液管在表面前后滾動幾次，以除去濾紙和支撐物之間的氣泡。
3. 剪一片用于印跡實(shí)驗(yàn)的薄膜和兩張比凝膠四周都大1 mm左右的Whatman 3MM濾紙。
   小貼士：在使用印跡薄膜的時候，一定要佩戴手套。仔細(xì)的用手操作薄膜的邊緣，或者使用干凈的鈍末端的鉗子操作。
4. 將準(zhǔn)備好的凝膠上端朝下放置在平臺上。用移液管在凝膠上前后滾動幾次，以去除凝膠和平臺之間的氣泡。
5. 使用保鮮膜包裹凝膠。這能確保10x SSC溶液穿過而不是在其周圍流動。
6. 將預(yù)先剪好的印跡薄膜放置在凝膠上面，以覆蓋整個凝膠表面。印跡薄膜一旦放置在凝膠上之后，不要移動。如步驟4中所述，去除它們之間的所有氣泡。
7. 使用10x SSC潤濕兩張預(yù)先剪好的Whatman 3MM濾紙，然后將它們放置在尼龍膜的表面。如步驟4中所述，去除它們之間的所有氣泡。
8. 將一疊15–20 cm厚的干紙巾放置在濾紙的表面。
   小貼士：確保包裹在凝膠周圍的保鮮膜能防止紙巾與10x SSC或者凝膠底部的濕濾紙接觸。確保紙巾不要垂下去，因?yàn)檫@樣它們會導(dǎo)致液體在凝膠周圍流過，而不是穿過凝膠。
9. 將另外一塊玻璃或者有機(jī)玻璃板放置在紙巾的表面。將重物放置在玻璃板上方。轉(zhuǎn)移過程大概需要12–18 h。
   小貼士：在轉(zhuǎn)移過程中，至少將浸濕的紙巾更換成干紙巾一次，這樣可以改善轉(zhuǎn)移的效率。

將DNA固定在印跡薄膜上

1. 在轉(zhuǎn)移完成之后，去除重物，紙巾和兩層濾紙。將凝膠和印跡薄膜一起翻轉(zhuǎn)，凝膠一面朝上，放置在干躁的濾紙上。使用原子筆或者軟芯鉛筆在薄膜上標(biāo)記凝膠泳道的位置。將凝膠從膜表面剝除。如果需要的話，可以保留凝膠，以評價DNA轉(zhuǎn)移的效率，否則的話可以扔掉凝膠。
   在將凝膠從印跡膜表面去除的時候，確保凝膠的泳道標(biāo)記出來，這樣它們稍后能被分辨出來。
   為了評價DNA轉(zhuǎn)移的效率，在印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，使用溴化乙錠將凝膠染色，以查看還有多少DNA殘留。
2. 使用烘烤法（步驟3）或者紫外光交聯(lián)法（步驟4）將DNA固定在印跡薄膜上。
   小貼士：與烘烤發(fā)相比，紫外光交聯(lián)法通常可以得到更好的結(jié)果和更高的靈敏度。但是，有效的交聯(lián)需要對系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。
3. 使用這一步或者步驟4：為了使用烘烤法將DNA固定在薄膜上，首先將印跡薄膜在濾紙上晾干，然后將其放置在兩層濾紙之間，在80°C的條件下，烘烤2 h。然后進(jìn)行步驟5。
4. 使用這一步或者步驟3：為了使用紫外光交聯(lián)法固定DNA，首先用保鮮膜覆蓋紫外光源（比如透射儀），以保護(hù)薄膜的表面。然后將潮濕的印跡薄膜的帶有DNA的一面暴露在紫外光源下一定的時間。然后進(jìn)行步驟5。 
   小貼士：對于紫外交聯(lián)，優(yōu)化系統(tǒng)非常重要。為了做到這一點(diǎn)，需制備包含幾個對照DNA樣本的印跡薄膜。將薄膜的每條泳道剪成獨(dú)立的長條，然后將每個長條照射不同的時間，從0.5 min到5 min不等。將所有的印跡薄膜同時進(jìn)行雜交，確定多長時間的照射能獲得最佳的信號強(qiáng)度。對于每一個實(shí)驗(yàn)，使用相同的條件（紫外光波長，到紫外光源的距離等）是至關(guān)重要的。定期標(biāo)定系統(tǒng)也是很重要的，因?yàn)樽贤夤庠吹妮椛鋸?qiáng)度，隨著使用會逐漸減弱。
   小貼士：紫外光會傷害眼睛和皮膚。一定要佩戴合適的護(hù)目鏡和面罩。
5. 如果不是立即使用印跡薄膜，可以將其用保鮮膜包裹，然后儲存在室溫下。

DNA回收

DNA回收是有效地進(jìn)行下游的實(shí)驗(yàn)（比如克隆、測序、微陣列分析或者擴(kuò)增）的前提條件。

這需要使用專用的試劑盒，試劑盒根據(jù)反應(yīng)類型、DNA片段大小（比如，PCR產(chǎn)物，凝膠提取物，酶反應(yīng)產(chǎn)物，核苷酸去除，染料終止子去除）和要求洗脫體積的不同，會有差別。

標(biāo)準(zhǔn)的PCR回收，僅需要去除約20種核苷酸左右的寡聚物。在二代測序(NGS)的文庫制備中，通常必須去除更大的引物——幾乎達(dá)到PCR擴(kuò)增子的大小范圍——因此PCR回收可能不充分。對于這種特別的“大小篩選”流程，需要專用的試劑盒或者基于PEG的沉淀方法。

參考文獻(xiàn)

1. Ausubel, F.M., et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
2. Animal Genome Size Database — www.genomesize.com.
3. Systma, K.K., Givnish, T.J., Smith, J.F., and Hahn, W.J. (1993) Collection and storage of land plant samples for macromolecular comparisons. Methods Enzymol. 234, 23.
4. Birnboim, H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids. Res. 7, 1513.
5. Birnboim, H.C. (1983) A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol. 100, 243.
6. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
7. Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.
8. Lis, T., and Schleif, R. (1975) Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2, 383.