由此可見有關(guān)qPCR制定一個(gè)實(shí)驗(yàn)和發(fā)表標(biāo)準(zhǔn)是多么的重要。不過幸好，Clin Chem. 2008年發(fā)表一篇文章，就是一群qPCR大牛經(jīng)過商討制定的qPCR實(shí)驗(yàn)和發(fā)表文章指南。雖然文章有些年限，但是對(duì)我們研究還是很有用的。因此科研動(dòng)力打算在此貼出。
這篇指南題為實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)研究發(fā)表最小信息(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, MIQE)，目的就是為了幫助確認(rèn)科學(xué)文獻(xiàn)的完整性，提高不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的一致性，并且提高實(shí)驗(yàn)的透明度。
MIQE是描述評(píng)估qPCR實(shí)驗(yàn)的所需的最小信息，該指南是稿件投稿時(shí)需要同時(shí)提交的一個(gè)清單。通過作者提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)相條件和實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，審稿人可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所用方法的可靠性。另外提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)所用試劑、序列和分析方法，其他研究人員可以利用這些信息進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。MIQE的細(xì)節(jié)應(yīng)當(dāng)作為在線發(fā)表的一個(gè)附件或者簡要形式同時(shí)發(fā)表。
實(shí)時(shí)定量PCR可以通過熒光定量檢測和測量微小量的核酸，適用范圍很廣，可以檢測多種不同來源的組織樣本，在分析診斷學(xué)，生命科學(xué)，農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)中應(yīng)用很廣，是一種優(yōu)秀的技術(shù)方法。
因?yàn)閝PCR操作簡單，檢測速度快，敏感性和特異性好，還可以對(duì)核酸定量的特點(diǎn)，qPCR已成為核酸定量實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。qPCR除了作為一種研究方法，其在診斷中也有廣泛應(yīng)用，如微生物定量，基因定量，轉(zhuǎn)基因食品中外源基因的鑒定，癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及法醫(yī)中的應(yīng)用。
利用qPCR技術(shù)的研究文獻(xiàn)也是數(shù)量驚人，這些文章使用不同的試劑，方法，分析法和報(bào)道格式。但是由于缺乏如何最佳的操作qPCR實(shí)驗(yàn)共識(shí)，qPCR一些不足可能會(huì)引起很多不良后果，這阻礙了qPCR成為一個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)。影響qPCR檢測性能的技術(shù)上的不足包括以下幾點(diǎn)。
- 缺少足夠的樣本，制劑和核酸質(zhì)量，從而產(chǎn)生高度可變的結(jié)果。
- 反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物以及探針選擇性差，導(dǎo)致效率低下，與其強(qiáng)大的檢測性能不成比例。
- 不恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析，產(chǎn)生可能是高度誤導(dǎo)的結(jié)果。
因此大量有關(guān)qPCR發(fā)表的文獻(xiàn)中存在結(jié)果證據(jù)不足甚至是相互矛盾的結(jié)果，這對(duì)科學(xué)研究是一個(gè)很大的危險(xiǎn)。科學(xué)文獻(xiàn)的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數(shù)研究報(bào)告缺少足夠的信息加劇了這個(gè)問題，使用qPCR的文獻(xiàn)沒有提供足夠的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以讓讀者評(píng)估結(jié)果的質(zhì)量或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)。具體表現(xiàn)為樣本的采集和處理信息，RNA質(zhì)量和完整性，反向轉(zhuǎn)錄細(xì)節(jié)，PCR效率，以及分析參數(shù)等等，這些信息常常被忽略，然而樣本正規(guī)化是反對(duì)沒有價(jià)值的單一參考基因。
本文的目的是為作者、審稿人和編輯提供一個(gè)最低限度的信息(附表，見文末，并且提供PDF和Excel版本下載)，是qPCR實(shí)驗(yàn)必須附加的信息，以保證實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性、正確的解釋和可重復(fù)性。MIQE參照了類似的DNA微陣分析草案，蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，基因序列規(guī)范，以及有關(guān)RNA干擾和代謝組學(xué)討論等內(nèi)容。該指南最初都是在MIBBI (Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, http://www.mibbi.org)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。雖然很多指南最終會(huì)發(fā)展成強(qiáng)制數(shù)據(jù)分享使用同一格式，但是MIQE并不建議這樣做。MIQE的目的是提高結(jié)果的可靠性，以資保證科學(xué)文獻(xiàn)的完整性，提高不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的一致性，以及提高實(shí)驗(yàn)的透明度。應(yīng)當(dāng)結(jié)合最近發(fā)表的文獻(xiàn)閱讀qPCR的指南，這樣可以深度操作qPCR的標(biāo)準(zhǔn)化。
該指南由9部分組成，共85個(gè)參數(shù)，以確保以qPCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性、正確的解釋和可重復(fù)性。這9部分包括：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Experimental design)，樣本(Sample)，核酸提取(Nucleic acid extraction)，反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription)，靶基因(qPCR target information)，qPCR引物和探針(qPCR oligonucleotides)，qPCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告(qPCR protocol)，qPCR合理性(qPCR validation)和數(shù)據(jù)分析(Data analysis)。85個(gè)參數(shù)視其對(duì)發(fā)表qPCR結(jié)果時(shí)的必要性，分為兩類：標(biāo)記為「E」表示必須(essential)，標(biāo)記為「D」者表示建議(desirable)。
1. 術(shù)語
首先先定義幾個(gè)術(shù)語先以確保澄清事實(shí)。
1.1 實(shí)時(shí)定量PCR的簡寫
建議實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative real-time PCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為qPCR，反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription–qPCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為RT-qPCR。用RT-PCR簡寫表示qPCR可以引起混亂，并且與傳統(tǒng)RT-PCR的平常應(yīng)用不符。
1.2 內(nèi)參基因
內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
1.3 TaqMan探針
TaqMan探針應(yīng)指的是水解探針(hydrolysis probes)。
1.4 FRET probe
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機(jī)制，基于2個(gè)熒光基團(tuán)的電子激發(fā)狀態(tài)之間的相互作用的基礎(chǔ)上的發(fā)光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
1.5 定量 quantification
牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當(dāng)?shù)摹?
1.6 Cq
現(xiàn)在文獻(xiàn)中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(diǎn)(crossing point, Cp)和分支點(diǎn)(take-off point, TOP) 與PCR反應(yīng)周期中的術(shù)語不一致。這些術(shù)語指的實(shí)際上在實(shí)時(shí)儀器是相同的值，只是不同儀器廠家為了競爭給自己產(chǎn)品的特定定義，不具有準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)記語言的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(www.rdml.org)，建議同一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個(gè)術(shù)語。
2. 概念
為了解釋指南，我們回顧一下qPCR實(shí)驗(yàn)有關(guān)的一些關(guān)鍵性問題。
2.1 分析敏感性(Analytical sensitivity)
分析敏感性指實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)可以確測量樣本的最小拷貝數(shù)，而臨床敏感性(clinical sensitivity)指實(shí)驗(yàn)可以確定患種疾病的陽性人數(shù)的百分比。通常靈敏度表示為檢測限(limit of detection, LOD)，即分析方法可以檢測濃度的合理定性(常用95%的概率)。最敏感的LOD理論上可能是3拷貝/PCR，假設(shè)符合泊松分布，PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個(gè)拷貝。實(shí)驗(yàn)步驟通常包括樣本處理(如提取)，有時(shí)還需要反向轉(zhuǎn)錄過程。如果總量有變化，這些步驟的效率可以引起多數(shù)LOD敏感性變化，理論上表現(xiàn)在可能在與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的單元上，如每克組織的拷貝數(shù)。不應(yīng)報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果少于理論上LOD可能性的結(jié)果。同樣結(jié)果為「0」也是無意義和可引起誤導(dǎo)的。因?yàn)楫?dāng)模板濃度是0時(shí)Cq是不確定的，在qPCR分析LOD的評(píng)估因Cq的對(duì)數(shù)而變得復(fù)雜。在qPCR中適當(dāng)?shù)拇_定和調(diào)節(jié)LOD是持續(xù)研究的重點(diǎn)。
2.2 分析特異性(Analytical specificity)
分析特異性指qPCR檢測相應(yīng)的靶序列而不是樣本中其他同樣表達(dá)的非特異性序列。診斷特異性是(Diagnostic specificity)指實(shí)驗(yàn)確定為陰性的沒有某種疾病的百分比。
2.3 精度(Accuracy)
精度指實(shí)驗(yàn)測量和實(shí)際濃度之間的差異，代表了倍數(shù)變化或者估計(jì)拷貝數(shù)。
2.4 重復(fù)性(Repeatability)(短期精度或者批內(nèi)變異(intraassay variance))
重復(fù)性指同樣樣本使用同樣方法重復(fù)檢測的精度和穩(wěn)定性。可以用Cq的SD變化表示，也可用拷貝數(shù)或濃度變化的SD或者CV來表達(dá)。但是不能用CVs和Cqs表達(dá)。
注：批內(nèi)變異指一個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的一組數(shù)據(jù)的變異。每個(gè)樣本測量多次，多次測量之間的差異。
2.5 再現(xiàn)性(Reproducibility)(長期精度或者批間變異(interassay variance))
再現(xiàn)性指不同實(shí)驗(yàn)室或者操作之間的結(jié)果變化，通常表現(xiàn)為拷貝數(shù)或濃度的SD或者CV。Cq值一般由不同操作產(chǎn)生，服從于固有的批間變異(interrun variation)，因此單純的報(bào)道批間Cq變化并不恰當(dāng)。
文章中描述靶基因的mRNA濃度應(yīng)該可以使靶基因更精確。多數(shù)人類基因和其他多核細(xì)胞生物中的很多基因的轉(zhuǎn)錄是選擇性剪接，這些剪接變化可以改變蛋白質(zhì)亞型，不同組織或者不同時(shí)期都有這種剪接模式的變化。因此單一外顯子RT-qPCR法可能檢測到許多剪接變化，但是內(nèi)含子引物可能更有選擇性，但是這又可能丟失一些剪接變異。最近有報(bào)道稱常染色體非印跡基因(nonimprinted genes)表達(dá)時(shí)表現(xiàn)為等位基因失衡。總之，使用RT-qPCR評(píng)價(jià)一個(gè)靶基因或者最多2個(gè)外顯子的mRNA不足以表現(xiàn)特定基因水平。因此作者要把引物序列信息及其相對(duì)于已知剪接體變化的特異性，以及單核核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)等這些信息記錄在案和單核核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫中。對(duì)于選自RTprimerDB數(shù)據(jù)庫的引物設(shè)計(jì)倒很簡單，直接查詢RTprimerDB的網(wǎng)站(http://www.rtprimerdb.org)即可，這個(gè)數(shù)據(jù)庫包含了所有相關(guān)的信息。如果是商業(yè)公司提供的引物，還需要提供一些信息以及供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。強(qiáng)烈不建議使用未驗(yàn)證的商業(yè)分析結(jié)果，以及僅有in silico驗(yàn)證的商業(yè)分析。
必須記住的是檢測mRNA提供不了是否mRNA能翻譯成蛋白質(zhì)的信息，或者實(shí)際上能翻譯成一個(gè)功能蛋白質(zhì)的信息。
免疫組化，免疫蛋白印跡法，或者其他蛋白質(zhì)定量方法常不能定量細(xì)胞mRNA。現(xiàn)在已明確mRNA濃度和蛋白質(zhì)濃度之間的一致性，特別是mRNAs和多功能蛋白質(zhì)復(fù)合體中一個(gè)特定蛋白質(zhì)之間的一致性。現(xiàn)在已明確特定microRNA是了解基因表達(dá)非常重要的，因?yàn)樗炕痬RNA種類。
還應(yīng)注意多數(shù)RNA定量不是絕對(duì)的，而是相對(duì)的。由此用參考基因或者作為標(biāo)準(zhǔn)材料是至關(guān)重要的，任何評(píng)價(jià)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的有效性也必須考慮相對(duì)定量的參考基因。因此開發(fā)通用參考DNA和RNA標(biāo)準(zhǔn)材料，雖然很有用，但是不是一個(gè)萬能藥。
RT-qPCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的表達(dá)值的很多變異并不只是由于實(shí)驗(yàn)步驟的變異引起，而是由于不同數(shù)據(jù)處理算法的校正引起的，每個(gè)算法都是數(shù)據(jù)假設(shè)。因此雖然qPCR是試金石或者金標(biāo)準(zhǔn)，但是實(shí)際中這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是可變的，結(jié)果需要考慮分析和解釋復(fù)雜性。
3. 研究和診斷應(yīng)用
qPCR技術(shù)的應(yīng)用可以大致分為研究應(yīng)用和診斷應(yīng)用。研究應(yīng)用常用于分析量少的范圍廣泛的靶基因或者不同的樣本類型的靶基因。主要是需要解決有關(guān)分析敏感性和特異性等參數(shù)，在這種情況下分別是可以檢測多少個(gè)靶拷貝以及無模板對(duì)照(no-template controls, NTCs)是否確實(shí)是陰性。
診斷應(yīng)用卻是相反，它常用于分析一定數(shù)量的靶基因，但是需要一些樣本靶基因是高產(chǎn)的。雖然研究應(yīng)用也可用于診斷實(shí)驗(yàn)，但是臨床診斷實(shí)驗(yàn)有額外的要求，如分析的敏感性和特異性，也就是指有靶基因標(biāo)本能檢測出多少陽性結(jié)果，以及無靶基因樣本能檢測出多少陰性結(jié)果。甚至不同實(shí)驗(yàn)室之間的準(zhǔn)確度和精確度常由外部質(zhì)量控制程度控制。臨床實(shí)驗(yàn)室還要求可報(bào)告結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，樣本的是否重復(fù)檢測，假陽性/假陰性結(jié)果的解決方法，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室用于同樣和不同技術(shù)結(jié)果的相似似性。迄今為止只有幾個(gè)國際實(shí)驗(yàn)公司進(jìn)行該類實(shí)驗(yàn)，并且這些研究重點(diǎn)在于qPCR診斷實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。另外歐盟SPIDIA項(xiàng)目(Standardisationand Improvement of Generic Preanalytical Tools and rocedures for In-Vitro Diagnostics; http://www.spidia.eu)也有些實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)。
4. 樣本采集、處理和制備
樣本的采集可能是實(shí)驗(yàn)變異的第一個(gè)來源，特別是RNA實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閙RNA的特性易被樣本的采集和處理而不穩(wěn)定。建議新鮮組織可以保存在冰塊中，這對(duì)RNA的質(zhì)量和濃度沒有多大的影響，但是雖然這種保存方法對(duì)一些mRNA和組織是有效的，它也不可能普遍應(yīng)用。因此在樣本采集時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。由此應(yīng)詳細(xì)記錄組織樣本的采集以及是否及時(shí)處理等信息。如果樣本沒有及時(shí)處理，必須記錄是如何保存的，以及在什么情況下保存了多長時(shí)間。
樣本的簡要說明也是必不可少的。例如一個(gè)腫瘤樣本的顯微鏡鏡檢可以發(fā)現(xiàn)樣本由腫瘤細(xì)胞組成的比例，這些信息也需要報(bào)道。
核酸的提取是第二個(gè)關(guān)鍵步驟。提取效率取決于足夠的同質(zhì)化，樣本的類型(如原位組織和培養(yǎng)組織)，樣本密度，生理狀態(tài)(如健康、癌癥或者壞死)，基因復(fù)雜性，以及處理量。因此必須記錄核酸取方法的細(xì)節(jié)，以及檢測核酸濃度和評(píng)估質(zhì)量的方法。這些細(xì)節(jié)對(duì)從新鮮冰凍顯微切割標(biāo)本中提取RNA特別重要，因?yàn)榻M織提取過程對(duì)RNA的數(shù)量和質(zhì)量影響很大。
5. 核酸質(zhì)量控制
5.1 RNA樣本
提取樣本中的RNA定量分析很重要，因?yàn)楸容^不樣本時(shí)，使用大致相似相同數(shù)量的RNA是明智的。平常使用的有幾種量化方法，如分光光度法(NanoDrop; Thermo Scientific)，微流控分析法(Agilent Technologies’ Bioanalyzer, Bio-RadLaboratories’ Experion)，毛細(xì)管凝膠電泳法(Qiagen’s QIAxcel)，或者熒光染料檢測法(Am-bion/Applied Biosystems’ RiboGreen)。這些方法可以有不同的結(jié)果，因此用不同方法比較結(jié)果是不明智的。定量RNA推薦使用熒光RNA結(jié)合染料(如RiboGreen)，該方法是檢測低濃度樣本最好的方法。建議任何情況下檢測所有樣本使用同一種方法，并且報(bào)道這些信息。
外源性基因組DNA污染程度和這種污染容忍的閾值也是很重要的。必須報(bào)道RNA樣本是否經(jīng)過DNase處理(包括DNase類型和反應(yīng)條件)，每個(gè)核酸樣本的獲得的Cqs研究組和非反轉(zhuǎn)錄的控制組的陽性果之間比較結(jié)果。
RNA模板的質(zhì)量評(píng)估也是必不可少的，唯一例外當(dāng)提取的總RNA質(zhì)量太低以至于不能評(píng)價(jià)質(zhì)量時(shí)。這種情況一般發(fā)生在從單一細(xì)胞、血漿或其它體液中提取RNA，以及一些激光捕獲樣本或者組織培養(yǎng)收集的樣本提取RNA時(shí)。這種情況同樣適用于RT-qPCR持續(xù)單管試驗(yàn)。需要報(bào)道RNA數(shù)量，融合和沒有反轉(zhuǎn)錄或PCR抑制劑等關(guān)鍵信息。應(yīng)該記住體內(nèi)RNA降解是由于mRNA因自然刺激的自然調(diào)節(jié)。RNA降解是研究人員無法控制的，其表現(xiàn)之一是高質(zhì)量的RNA樣本可以表現(xiàn)單個(gè)mRNAs的不同降解。
A260/A280比值必須在中性PH值buffer中測量，但是這個(gè)比值如果于核酸用于定量分析，尤其是目的是為了測量細(xì)胞mRNA濃度的微小差異(＜10倍)時(shí)，這個(gè)比值不夠用。吸收度比值提供了RNA純度指標(biāo)，因?yàn)镈N或者殘余苯酚可以改變這個(gè)比率。因此至少應(yīng)該提供凝膠電泳證據(jù)，或者更好能提供微流控芯片的rRNA分析結(jié)果，或者一個(gè)參考基因/靶基因3’:5’完整性檢測。使用Bioanalyzer/Experion系統(tǒng)計(jì)算RNA完整性數(shù)量或RNA質(zhì)量指標(biāo)數(shù)量的優(yōu)點(diǎn)是這些指標(biāo)可以提供有關(guān)RNA樣本一般狀態(tài)的定量信息。但是要記住這些與rRNA質(zhì)量有關(guān)的數(shù)字不能期望作為質(zhì)量的絕對(duì)指標(biāo)。使用3’:5’分析要求兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的PCR效率幾乎相同，不受不同抑制劑的控制。這個(gè)實(shí)驗(yàn)還需要一個(gè)閾值來定義RNA質(zhì)量產(chǎn)量不足可信結(jié)果。理想狀太下檢測目標(biāo)是一組「可靠參考基因」，可能沒有內(nèi)含子，3’:5’的倍數(shù)大約是0.2-5。顯然需要進(jìn)一步的工作開發(fā)一個(gè)評(píng)價(jià)RNA完整性的工具，既有普遍適用性，又有成本效益和操作簡單。
應(yīng)當(dāng)通過稀釋樣本(最好)檢測反轉(zhuǎn)錄活性或者PCR抑制劑，或者使用一般的抑制試驗(yàn)如SPUD。如果RNA樣本部分降解，這個(gè)信息必須報(bào)道，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的低水平轉(zhuǎn)錄檢測敏感性可能減少，轉(zhuǎn)錄的降解的相對(duì)差異可能引起不正確的比率。
5.2 DNA樣本
一般情況下DNA降解比較少，但是法醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)外源性DNA降解是重要的，如惡劣環(huán)境犯罪或者大規(guī)模災(zāi)害，或者涉及失蹤人員案件中，DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)降解。qPCR擴(kuò)增片段大小可以幫助減少測定有關(guān)的問題，但是開發(fā)供DNA質(zhì)量的定量檢測方法可用于這種特殊用途。
可能的抑制劑是更普遍可變因素，必須在發(fā)表中指出，沒有抑制劑純化的DNA可能會(huì)扭曲結(jié)果，比如病原體的檢測和量化。雖然可以添加樣本與陽性對(duì)照來檢測抑制劑，但是不同的PCR反應(yīng)可能會(huì)受抑制劑影響。因此最好是常規(guī)使用核酸稀釋來證明Cqs或拷貝數(shù)的減少是與預(yù)期結(jié)果一致的。
6. 反轉(zhuǎn)錄
反轉(zhuǎn)錄步驟可以引起RT-qPCR的實(shí)質(zhì)性變異。因此詳細(xì)描述轉(zhuǎn)化RNA成cDNA的方法和試劑是必不可少的。RNA反轉(zhuǎn)錄的量，啟動(dòng)策略，酶的類型，數(shù)量，溫度，持續(xù)時(shí)間和反轉(zhuǎn)錄步驟等等這些信息必不可少。建議反轉(zhuǎn)錄步驟可以進(jìn)行次或者三次，每個(gè)樣本中總RNA濃度應(yīng)是相同的。
7. qPCR
以下信息qPCR試驗(yàn)必須提供的：數(shù)據(jù)庫登陸每個(gè)靶基因和參考基因的數(shù)目，每個(gè)引物和任何探針的外顯子位點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸的濃度和序列，包括性質(zhì)、位點(diǎn)和結(jié)合任何染料和/或修飾堿基。同樣需要聚合酶的名稱和濃度，每個(gè)反應(yīng)的模板(DNA或RNA)數(shù)量，Mg2+濃度，緩沖液中確切化學(xué)組成(鹽、PH值、添加劑)，以及反應(yīng)量。研究人員還必須確認(rèn)他們所使用的儀器，所有PCR循環(huán)條件的文件。因?yàn)樗褂玫暮牟挠绊憻嵫h(huán)，必須確定使用單一試管、帶或者板，以及它們的制造商。所使用的塑料制品的透明度，如白色或者透明，這也重要，因?yàn)椴煌乃芰系臒晒夥瓷涿舾行圆煌．?dāng)使用板時(shí)，密封(熱粘合或粘合劑)的方法可以影響板周邊樣品的蒸發(fā)，這也要記錄。
因?yàn)镻CR效能高度依賴于所使用的引物，因此引物的序列必須發(fā)表。這個(gè)要求是完全可行的，甚至是商業(yè)性的引物，因?yàn)橛邢壤?http://www.primerdesign.co.uk/research_with_integrity.asp)。
另外強(qiáng)烈建議提交給公共數(shù)據(jù)庫，如RTprimerDB，這些數(shù)據(jù)庫可以成為通用的交換所。
7.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)
目標(biāo)核酸的結(jié)構(gòu)(如RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu))對(duì)反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率有重要影響。因此，引物和探針的位點(diǎn)，以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的位點(diǎn)必須考慮RNA的折疊。可以用核苷酸折疊軟件仔細(xì)核實(shí)序列，這類軟件有DNA的mfold(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)，或者RNA的mfold(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1-2.3.cgi)。理想狀態(tài)下折疊結(jié)構(gòu)應(yīng)該提供給審稿人。
7.2 特異性
In Silico 工具如 BLAST 或者等效性搜索是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有用的。應(yīng)當(dāng)記錄任何可預(yù)測的假基因的同源或者其它不可預(yù)見的基因，并且作為一個(gè)序列比對(duì)提供給審稿人。但是特異性必須用直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(凝膠電泳，解鏈曲線圖形，DNA序列，擴(kuò)增片段大小，和/或限制性酶切)驗(yàn)證有效性。
設(shè)計(jì)之初可預(yù)測寡核苷酸的熔解溫度(Tm)的算法，但是退火的實(shí)際最佳溫度必須通過實(shí)驗(yàn)決定。雖然引物優(yōu)化已成為過去時(shí)，但是不當(dāng)?shù)耐嘶饻囟葍?yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量有很大的影響還是明確的。引物二聚體的顯可引起PCR低效率，在探針和SYBRGreen Ⅰ的實(shí)驗(yàn)中可能產(chǎn)生假陽性。引物優(yōu)化的一些證據(jù)應(yīng)提給審稿人，最好還要提交退火溫度或者M(jìn)g2+濃度，Cq值，熒光點(diǎn)陣圖與循環(huán)次數(shù)，和/或熔解曲線。
7.3 控制和量化標(biāo)準(zhǔn)
除了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)上面所提到的非反轉(zhuǎn)錄控制外，所有qPCR反應(yīng)還需要更多的控制和/或量化標(biāo)準(zhǔn)。在SYBR Green I反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)用探針區(qū)別預(yù)期PCR產(chǎn)物中區(qū)別不可預(yù)知的擴(kuò)增產(chǎn)物(如引物二聚體)時(shí)，應(yīng)用NTCs檢測PCR污染。NTCs應(yīng)當(dāng)包含在每個(gè)板或者批樣品中，并建立拒絕條件。如果Cq值未知最高值為35，那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。
從實(shí)驗(yàn)樣本中提取的核酸的陽性對(duì)照可用于監(jiān)測實(shí)驗(yàn)隨時(shí)間變化，并且當(dāng)每次操作不執(zhí)行校準(zhǔn)曲線時(shí)陽性對(duì)照就必不可少。
量化校準(zhǔn)器可以純化靶分子，如RNA合成或DNA寡核苷酸生成完整PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)，cDNA克隆成質(zhì)粒，RNA體外轉(zhuǎn)錄，參考RNA，特定生物樣品的RNA或者DNA，或者國際公認(rèn)的生物標(biāo)準(zhǔn)(如果有)。稀釋到規(guī)定tRNA載體(酵母或者10-100ng/L的大腸桿菌)濃度。為了檢測人的病原體，避免引起載體tRNA出現(xiàn)溶解，校準(zhǔn)可以稀釋成陰性對(duì)照樣本RNA或者DNA，或者把它們稀釋到健康人的血漿。特定模板的稀釋可為存儲(chǔ)作準(zhǔn)備，能抵抗幾個(gè)凍溶循環(huán)。當(dāng)Cq變化0.5-1.0時(shí)準(zhǔn)備幾個(gè)新鮮稀釋。另外在4℃存儲(chǔ)一周，超過一周就要丟棄。
qPCR用于診斷分析應(yīng)包括一個(gè)獨(dú)立的校正標(biāo)準(zhǔn)， 一般位于實(shí)驗(yàn)的線性區(qū)間內(nèi)。同樣也建議陽性和陰性提取對(duì)照。
7.4 檢測性能
必須確定下面的實(shí)驗(yàn)特性：PCR效率，線性動(dòng)態(tài)范圍，LOD，精度。
7.4.1 PCR效率
穩(wěn)定和精確的qPCR實(shí)驗(yàn)常和PCR效率有關(guān)。當(dāng)靶基因相對(duì)于參考基因的mRNA濃度時(shí)PCR的效率特別重要。△△Cq法是基于單一參考基因的標(biāo)準(zhǔn)化最流行確定不同濃度樣本的差異性的方法。計(jì)算靶基因和參考基因Cq值(△Cq)的差異，直接比較不同樣本△Cqs。擴(kuò)增兩個(gè)基因以比較這兩個(gè)基因的效率。但是最流行的方法不一定是最合適的，不過現(xiàn)在已開發(fā)替代的定量模型用于糾正擴(kuò)增效率，還可以使用多個(gè)參考基因。
PCR擴(kuò)增效率必須建立校準(zhǔn)曲線，因?yàn)檫@種校準(zhǔn)提供了一個(gè)簡單、快速以及可重復(fù)PCR效率、分析敏感性和實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性的平均指標(biāo)。效率放大應(yīng)當(dāng)從l校準(zhǔn)曲線的og線性部分的斜坡部分決定。具體而言PCR效率＝10-1/slop-1，初始模板濃度的對(duì)數(shù)(獨(dú)立變量)是X軸，Cq(依賴變量)是Y軸。理論最大值為1.00(或100%)表示每個(gè)周期的產(chǎn)物量加倍。理想狀態(tài)下PCR的估計(jì)平均效率的CIs或SEs服從校準(zhǔn)曲線。
每個(gè)量化目標(biāo)的校準(zhǔn)曲線必須包含在提交稿件中，這些信息審稿人可以看到。校準(zhǔn)曲線的斜率和Y截距必須包含在發(fā)表中。不同PCR效率可以產(chǎn)生不同的校準(zhǔn)曲線和不同的斜率。因此靶基因和參考基因的Cq值不同可以保持不變，但是模板量是變化的，計(jì)算相對(duì)濃度是不準(zhǔn)確的，易產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果。
Cq＞40是可疑的，因?yàn)閿U(kuò)增效率低。使用這種Cq值是不理想的，因?yàn)樗鼈兛赡芴?沒有有效的結(jié)果)或者太高(假陽性結(jié)果增加)。
7.4.2 線性動(dòng)態(tài)范圍
反應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍是線性的(最高到最低量化的拷貝數(shù)通過校準(zhǔn)曲線表示)。根據(jù)生成校準(zhǔn)曲線的模板，動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)當(dāng)包括至少3個(gè)數(shù)量級(jí)，理想狀態(tài)5或6 log10濃度。校準(zhǔn)曲線的線性間隔必須包括目標(biāo)核酸量化的間隔。因?yàn)榱炕牡拖蕹２幻鞔_，應(yīng)當(dāng)確定線性間隔內(nèi)最低濃度的變化。必須報(bào)道相關(guān)系數(shù)(r2值)，理想是CIs應(yīng)當(dāng)通過整個(gè)線性動(dòng)態(tài)范圍。
7.4.3 LOD
LOD為檢測到陽性樣本最低濃度為95%。換句話說，包含一組靶基因復(fù)制內(nèi)LOD的濃度最多不超過5%失敗反應(yīng)。低拷貝PCRs是隨機(jī)有限的，不可能出現(xiàn)LODs為3個(gè)拷貝/PCR。如果是多個(gè)反應(yīng)，可通過數(shù)字PCR得到低濃度的準(zhǔn)確定量。實(shí)際上濃度校準(zhǔn)器可以通過檢測有限的稀釋，失敗和成功反應(yīng)的百分比符合Poisson分布。
7.4.4 精度
很多因素可以解釋qPCR結(jié)果的變異，包括溫度的差異可影響退火和/或變性，濃度不同可由移液濃度錯(cuò)誤引起，以及隨機(jī)變異。qPCR精度的一般隨著拷貝數(shù)減少而變化。理想狀態(tài)是實(shí)驗(yàn)內(nèi)變異(重復(fù)性)在圖中應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)誤，或者重復(fù)樣本的在校準(zhǔn)曲線作為CIs。CVs不能用作Cqs，但是可用于表達(dá)拷貝數(shù)或濃度的變化。這種技術(shù)上的變化應(yīng)該有別于生物變異。生物復(fù)制可直接解決不同組或治療組之間的qPCR結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。診斷分析，報(bào)道不同部位和不同操作者之最批間精度(重復(fù)性)可能同樣是必須的。
7.4.5 多重qPCR
qPCR分析的能力可以擴(kuò)展到多重的，特別是就應(yīng)用于同時(shí)檢測點(diǎn)突變或多態(tài)性檢測。多重需要提供證據(jù)表明多個(gè)目標(biāo)的準(zhǔn)確量化在單一管中不受損，比如檢測效率和LOD是相同的，當(dāng)檢測單工模式時(shí)。當(dāng)靶基因濃度很低又和高濃度的靶基因同時(shí)擴(kuò)增時(shí)這個(gè)問題尤其重要。
8. 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析包括原始數(shù)據(jù)檢查，其質(zhì)量和可靠性評(píng)估，以及可值得報(bào)告結(jié)果的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)采集和提交的變異策略已描述過了，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)顯示qPCR的數(shù)據(jù)分析方法不同于其性能。
數(shù)據(jù)分析方法和可信度估計(jì)的詳細(xì)信息是必須的，同時(shí)所使用的軟件說明書。確定殿堂值和如何處理這些數(shù)據(jù)的方法必須指出。記錄實(shí)驗(yàn)精度需要確認(rèn)用于評(píng)價(jià)變異的統(tǒng)計(jì)方法(如95% CIs)和相應(yīng)的濃度或Cq值的出現(xiàn)。這些信息應(yīng)包括重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)據(jù)，如果可用。如上所述，報(bào)告CVs為Cqs是不恰當(dāng)?shù)模驗(yàn)镃qs常低于(因此可能誤導(dǎo))CVs計(jì)算的拷貝數(shù)量值。信息必須提供用于評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性的方法，包括組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
8.1 規(guī)范化(Normalization)
規(guī)范化是一個(gè)可知的qPCR檢測重要的組成部分，因?yàn)檫@個(gè)過程控制提取的變化，反轉(zhuǎn)錄的量，擴(kuò)增效率，從而可以通過不同樣本比較mRNA濃度。使用參考基因作為內(nèi)部控制是最常用規(guī)范化細(xì)胞mRNA數(shù)據(jù)的方法，但是雖然使用參考基因被大多數(shù)適當(dāng)規(guī)范化策略所接受，但是它們的用途必須為特定的組織或者細(xì)胞和特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效。不幸的是雖然大家越來越意識(shí)到系統(tǒng)性確認(rèn)的重要性，大家也知道使用不恰當(dāng)?shù)膮⒖蓟蜃鳛橐?guī)范有潛在的高度誤導(dǎo)性，但是很多人還是一直忽視這些因素。因此很多分子分析仍然包含沒有規(guī)范化的qPCR數(shù)據(jù)。
規(guī)范化涉及到報(bào)告研究基因和參考基因RNA濃度的比率。參考基因的mRNA應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)，它們的豐度應(yīng)當(dāng)和樣本中mRNA總量強(qiáng)相關(guān)。
規(guī)范化反對(duì)使用一個(gè)參考基因，除非研究人員有明確的給審稿人提供明確的證據(jù)，證實(shí)其在實(shí)驗(yàn)條件下保持不變。參考基因最佳數(shù)量和選擇必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測定和報(bào)告的方法來證實(shí)。
8.2 變異性
生物系統(tǒng)內(nèi)在的變異可能競爭或者超過實(shí)驗(yàn)兩組間的差異。當(dāng)多個(gè)生物提制用于增加實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)差異性時(shí)，這種變化更易觀察到。雖然生物復(fù)制之間的差異可能很大，但是足夠數(shù)量的樣本可以減少實(shí)驗(yàn)差異性。最近一份研究提供了處理這些數(shù)據(jù)的范例，如何從高生物變異實(shí)驗(yàn)樣本中提取有意義的數(shù)據(jù)。很多因素可以引起實(shí)驗(yàn)變異，影響生物復(fù)制的數(shù)量以實(shí)現(xiàn)給定的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。因此效率分析對(duì)決定樣本數(shù)量是有用的，對(duì)可靠的結(jié)果是必須的。
8.3 定性分析
PCR的使用僅檢測核酸模板的存在，而不是準(zhǔn)確量化，被稱為定性PCR，現(xiàn)在廣泛用于病原體的診斷。PCR方法定性/定量分層總是一個(gè)準(zhǔn)確是/否答案，需要低敏感性PCR實(shí)驗(yàn)的敏感性的信息。因此甚至定性分析應(yīng)當(dāng)提供實(shí)驗(yàn)操作的特性，特別是在7.4.2和7.4.3中討論的要點(diǎn)。
結(jié)論
現(xiàn)大大家認(rèn)為必須確保qPCR和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。qPCR和傳統(tǒng)的PCR之間最主要的不同是qPCR量化靶基因更準(zhǔn)確。由于這種差異，一個(gè)不能認(rèn)為傳統(tǒng)的PCR可以直接轉(zhuǎn)換成qPCR模式。表提供了作者發(fā)表qPCR研究的準(zhǔn)備清單。E項(xiàng)目是必須，不僅可以讓研究人員評(píng)價(jià)工作，還可以讓其他研究人員可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)。項(xiàng)目D同樣重要，建議研究中考慮這些條目。當(dāng)然運(yùn)用常識(shí)也很重要：上百個(gè)基因的初始篩選完成表中的所有項(xiàng)目到是不必要。但是一旦限制了靶基因(少于20個(gè))，實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)按照清單中的要求進(jìn)行，清單還可以在http://www.rdml.org/miqe.php查看。
總之這個(gè)指南的目的有3個(gè)：
1. 為了讓作者設(shè)計(jì)和發(fā)表qPCR實(shí)驗(yàn)有更大的內(nèi)在價(jià)值。
2. 為了讓審稿人和編輯可以評(píng)估技術(shù)質(zhì)量和不按既定標(biāo)準(zhǔn)的提交稿件質(zhì)量。
3. 為了遵循這個(gè)指南的作者已發(fā)表研究更易重復(fù)。
因此研究人員使用這個(gè)廣泛使用技術(shù)可以產(chǎn)生更規(guī)范，更可比的，更可知的數(shù)據(jù)。
附表：作者、審稿人和編輯MIQE清單
MIQE checklist for authors, reviewers, and editors
| Item to check | Importance |
| Experimental design | |
| Definition of experimental and control groups | E |
| Number within each group | E |
| Assay carried out by core lab or investigator's lab? | D |
| Acknowledgement of authors' contributions | D |
| Sample | |
| Description | E |
| Volume/mass of sample processed | D |
| Microdissection or macrodissection | E |
| Processing procedure | E |
| If frozen - how and how quickly? | E |
| If fixed - with what, how quickly? | E |
| Sample storage conditions and duration (especially for FFPE samples) | E |
| Nucleic acid extraction | |
| Procedure and/or instrumentation | E |
| Name of kit and details of any modifications | E |
| Source of additional reagents used | D |
| Details of DNase or RNase treatment | E |
| Contamination assessment (DNA or RNA) | E |
| Nucleic acid quantification | E |
| Instrument and method | E |
| Purity (A260/A280) | D |
| Yield | D |
| RNA integrity method/instrument | E |
| RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts | E |
| Electrophoresis traces | D |
| Inhibition testing (Cq dilutions, spike or other) | E |
| Reverse transcription | |
| Complete reaction conditions | E |
| Amount of RNA and reaction volume | E |
| Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration | E |
| Reverse transcriptase and concentration | E |
| Temperature and time | E |
| Manufacturer of reagents and catalogue numbers | D |
| Cqs with and without RT | D* |
| Storage conditions of cDNA | D |
| qPCR target information | |
| If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E |
| Sequence accession number | E |
| Location of amplicon | D |
| Amplicon length | E |
| In silico specificity screen (BLAST, etc) | E |
| Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs? | D |
| Sequence alignment | D |
| Secondary structure analysis of amplicon | D |
| Location of each primer by exon or intron (if applicable) | E |
| What splice variants are targeted? | E |
| qPCR oligonucleotides | |
| Primer sequences | E |
| RTPrimerDB identification number | D |
| Probe sequences | D** |
| Location and identity of any modifications | E |
| Manufacturer of oligonucleotides | D |
| Purification method | D |
| qPCR protocol | |
| Complete reaction conditions | E |
| Reaction volume and amount of cDNA/DNA | E |
| Primer, (probe), Mg++ and dNTP concentrations | E |
| Polymerase identity and concentration | E |
| Buffer/kit identity and manufacturer | E |
| Exact chemical constitution of the buffer | D |
| Additives (SYBR Green I, DMSO, etc.) | E |
| Manufacturer of plates/tubes and catalog number | D |
| Complete thermocycling parameters | E |
| Reaction setup (manual/robotic) | D |
| Manufacturer of qPCR instrument | E |
| qPCR validation | |
| Evidence of optimisation (from gradients) | D |
| Specificity (gel, sequence, melt, or digest) | E |
| For SYBR Green I, Cq of the NCT | E |
| Standard curves with slope and y-intercept | E |
| PCR efficiency calculated from slope | E |
| Confidence interval for PCR efficiency or standard error | D |
| r2 of standard curve | E |
| Linear dynamic range | E |
| Cq variation at lower limit | E |
| Confidence intervals throughout range | D |
| Evidence for limit of detection | E |
| If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E |
| Data analysis | |
| qPCR analysis program (source, version) | E |
| Cq method determination | E |
| Outlier identification and disposition | E |
| Results of NTCs | E |
| Justification of number and choice of reference genes | E |
| Description of normalisation method | E |
| Number and concordance of biological replicates | D |
| Number and stage (RT or qPCR) of technical replicates | E |
| Repeatability (intra-assay variation) | E |
| Reproducibility (inter-assay variation, %CV) | D |
| Power analysis | D |
| Statistical methods for result significance | E |
| Software (source, version) | E |
| Cq or raw data submission using RDML | D |
注：
1. All essential information (E) must be submitted with the manuscript. Desirable information (D) should be submitted if available. If primers are from RTPrimerDB, information on qPCR target, oligonucleotides, protocols, and validation is available from that source.
2. FFPE, formalin-fixed, paraffin-embedded; RIN, RNA integrity number; RQI, RNA quality indicator; GSP, gene-specific priming; dNTP, deoxynucleoside triphosphate.
3. Assessing the absence of DNA with a no–reverse transcription assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as DNA free, inclusion of a no–reverse transcription control is desirable but no longer essential.
4. Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged; however, because not all vendors of commercial predesigned assays provide thisinformation, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is discouraged.
*: Assessing the absence of DNA using a no RT assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as RDNA-free, inclusion of a no-RT control is desirable, but no longer essential.
**: Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged. However, since not all commercial pre-designed assay vendors provide this information, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is advised against.
本文編譯于：Bustin SA et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797. Epub 2009 Feb 26. PMID:19246619
